[发明专利]收集和扩增循环核酸的方法和装置

说明书

背景

本申请总体上涉及从生物学样本收集和扩增循环核酸(CNA)。更特别地，本申请涉及从生物学样本分离、收集、扩增和进一步检测循环核酸。

循环核酸从各种组织释放并在体液中积聚。各种完整和/或碎片的核酸已在CNA中鉴定，包括mRNA、miRNA、线粒体DNA、基因组DNA和反转录转座子。CNA理想地适合于疾病的早期检测以及预测和治疗诊断的应用。CNA的诊断潜力已在广泛的疾病谱，包括肿瘤发生、炎症、心肌梗死、自身免疫性疾病和妊娠相关并发症中得到证实。

循环核酸可使用采集体液样品的最小侵入方法检测。然而，CNA以极低丰度存在于体液中。因此，CNA的分析一般往往需要收集和处理大体积(毫升或升)的体液。然而，很多时候，只有非常少量的体液样本(微升)可供用来分析，特别是在体外诊断、病理学和法医学领域。此外，大体积的样本收集往往导致显著的装置成本、运输/处理成本和样本矫作物(artifact)。另外，因为CNA在体液中存在于细胞外，这种循环的核酸池可逐渐被通过体液中的定居细胞溶解释放的细胞内DNA或RNA淹没。这种淹没或污染可能是时间、温度、用于稳定的处理类型和用来分离体液的分离力的多参数函数。这些预分析变量可以从存在于体液中的定居细胞产生不希望的基因组污染。例如，在全血样本中，DNA或RNA可以在贮存和处理期间从血细胞释放到血浆或血清中。这可干扰存在于血浆或血清中的细胞外循环核酸的分析。循环核酸池的基因组污染可通过维持血样于4℃和在2小时内处理样本而减少。然而，这样的条件对于许多应用往往是不可行的和/或没有成本效益的。

全基因组扩增可用于扩大循环核酸的天然池。然而，先前使用多重置换扩增(MDA)技术的CNA全基因组扩增的尝试已强调与体液中CNA的劣质和低量有关的独特挑战。一般来说，CNA由于其本质上源自凋亡/坏死细胞，因而是高度片段化的。CNA的核酸片段化模式对于常规的全基因组扩增不是理想的，因而导致等位基因遗失和/或序列偏倚的扩增模式。另外，许多常规的全基因组扩增技术需要纳克量的输入核酸。因此，CNA必须从大体积的非-细胞部分提纯，以满足这些模板浓度要求。鉴于上述，存在对从生物学样本简化分离、收集、稳定和/或扩增循环核酸的技术的迫切需求，特别是当分析含有皮克量的CNA的小样本体积时。

发明简述

本发明涉及从生物学样本收集CNA和随后扩增CNA。

本发明的一个方面涉及一种存在于生物学样本的非-细胞部分中的循环核酸的扩增方法。该方法包括过滤生物学样本以将非-细胞部分与完整细胞分离，将分离的非-细胞部分收集到干燥的固体基质上，和从收集的非-细胞部分提取CNA的步骤。该方法还包括环化提取的CNA以形成单链核酸环，和通过随机-引物滚环扩增来扩增单链核酸环以形成扩增的CNA产物的步骤。如果CNA以双链形式存在，该方法还包括在用于制备单链核酸环的分子内连接反应之前将双链CNA变性为单链形式的步骤。线性单链CNA的环化可通过能够分子内连接单链核酸的连接酶实现。

本发明的另一方面涉及一种在收集点处理全血以收集含有循环核酸的血浆或血清的方法。该方法包括在收集点过滤全血以从全血分离血浆或血清，将分离的血浆或血清收集到干燥的固体基质上并在固体基质上干燥收集的血浆的步骤。固体基质没有任何去垢剂。

本发明的另一方面涉及一种从干燥的血浆或血清样本检测CNA的方法。该方法包括从干燥的血浆或血清提取CNA，进行提取的循环核酸的全基因组扩增以形成扩增的循环核酸(CNA)产物，和在扩增的CNA产物中检测特定循环核酸序列的步骤。全基因组扩增通过首先使用能够分子内连接单链核酸的连接酶环化提取的CNA以形成单链核酸环，和通过使用随机引物滚环扩增来扩增单链核酸环进行。如果CNA以双链形式存在，该方法还包括在分子内连接反应之前，将双链CNA变性为其单链形式的步骤。

本发明的另一方面涉及一种用于收集生物学样本的包含循环核酸的非-细胞部分的装置。该装置包括被配置以将生物学样本的非-细胞部分与完整细胞分离的过滤膜，和被配置以收集分离的非-细胞部分的干燥的固体基质。过滤膜和固体基质被配制以在它们之间建立直接的接触。此外，固体基质没有任何去垢剂。

附图

所述发明的这些和其它特征、方面和优势，当参照附图(其中贯穿整个附图的相同字符代表相同的部分)阅读以下详细描述时，将变得更易理解，其中：

图1描绘说明本发明方法的实施方案的流程图。