[发明专利]维持尺寸和生物学活性的冷冻干燥的聚电解质复合物

说明书

相关申请的参考

本申请要求要求于2013年6月10日提交的美国临时专利申请号61/833,010的权益 和优先权，其内容以其全部内容通过引用结合于此。

技术领域

本发明涉及在溶液中具有提高稳定性并对长期存储中的物理或化学降解具有改 善的抗性的聚电解质复合组合物；用于获得这种聚电解质复合组合物的方法以及这些聚电 解质复合组合物用于递送核酸的用途。

背景技术

近年来已经付诸了大量努力以开发用于递送治疗药物的纳米颗粒组合物，治疗药 物如但不限于蛋白质、肽、脱氧核糖核酸(DNA)、如质粒(pDNA)和寡脱氧核苷酸(ODN)、以及 核糖核酸如小干扰核糖核酸(siRNA)和小发夹核糖核酸(shRNA)。然而，显示这些胶态组合 物在溶液中具有有限的稳定性，并长期储存容易发生物理或化学降解[1]。

通过冷冻干燥(freeze-drying)，也称为冻干(lyophilization)，这些组合物的脱 水被用于提高它们的长期稳定性[2-4]。这个过程由3个主要步骤组成：冷冻、初级干燥和二 级干燥。它提供了在减少的体积中使干燥的组合物再水化以增加活性剂的浓度并达到治疗 剂量的可能性。这在自组装聚阳离子和核酸(NA)之间的聚电解质复合组合物的情况下是特 别令人感兴趣的，上述自组装需要在稀释条件下制备以产生小而尺寸均匀的纳米颗粒[1]。

一般需要向组合物中加入冻干保护剂以防止冻干时不可逆的聚结和溶液中纳米 颗粒的官能度的损失[4,5]。冻融研究允许识别待用于给定的组合物的潜在的冻干保护剂 [6,7]。二糖(如蔗糖、海藻糖、乳糖等)，寡糖/多糖(如纤维素、葡聚糖等)，聚合物(如PEG、 PVP等)等已经用作冻干保护剂以稳定长期存储的组合物[3,4]。海藻糖也将是一个极好的 纳米颗粒冻干保护剂[4,11-13]。然而，据发现在高温下储存时，冷冻干燥的无定形二糖会 比多糖更容易结晶，增加复合物聚结的风险[14]，但是多糖却被发现由于其蓬松是低效率 的冻干保护剂[15,16]。寡糖可能是优越的稳定剂，因为它们具有二糖和多糖对于复合物最 佳稳定都具有的有利性质[17]。已证明低分子量葡聚糖在冻干和再水化时保留阳离子多聚 物(polyplex)物理化学性质和功能方面是有效的，同时在体内和体外研究中与蔗糖相比保 持了更高的细胞活力[15]。

缓冲剂可以用于稳定pH和防止在通过冻干过程的冷冻阶段时发生的溶质的低温 浓缩期间纳米颗粒酸解[2]。必须谨慎选择冻干期间使用的缓冲剂，因为在冷冻期间某些会 结晶或沉淀(磷酸盐、琥珀酸盐或酒石酸盐)，引起pH值变化最高达4个单位[2，20-23]。Tg'， 指的是最大低温浓缩的溶液的玻璃化转变温度，是选择用于冷冻干燥的赋形剂时要考虑的 重要参数；它是能够实施初级干燥而不会影响最终产品的最高温度的良好估计。柠檬酸钠 是非结晶性缓冲剂，因为其在不同pH值的较高Tg'[22]及其接近中性的pK_a(pK_a3＝6.4) [24]，其适用于冻干的可注射组合物。L-组氨酸也能够是适用的，因为它的三个pKa值之一 为6.1，它在冷冻干燥时在pH5.5至6.5下几乎不表现出结晶，并且它具有高的Tg'(-33℃) [12，25]。使用赋形剂，主要是冻干保护剂和一些缓冲剂，对于用聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸) (PLGA)(U.S.2011/262490)[26-28]、聚(l-赖氨酸)(PLL)[29]、聚乳酸(PLA)(U.S.2011/ 0275704)[30]、明胶[31]、聚乙烯亚胺(PEI)[7，15，17，32-37]形成的冷冻干燥的聚电解质 复合组合物的开发，已经被表征。