[发明专利]用于梭菌转化的组合物和方法

说明书

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2013年6月21日提交的美国临时专利申请No. 61/838,224的优先权；将该专利申请的内容以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明提供用于梭菌的基因工程的组合物和方法，所述组合物和方 法用于生成工业生物产物和/或提高工业生物产物的生成效率。

背景技术

细菌限制修饰(R-M)系统具有多种特异性和策略，但其一般功能是 保护细菌免受外源DNA(例如来自噬菌体的DNA)的影响。R-M系统可 由DNA甲基转移酶和限制性核酸内切酶构成。DNA甲基转移酶催化甲基 从供体S-腺苷-L-甲硫氨酸(也称为“SAM”或“AdoMet”)转移到细菌 宿主的特定DNA序列内的腺嘌呤或胞嘧啶残基上，该特定DNA序列被称 为识别序列。根据所生成的产物的性质将DNA甲基转移酶分成三大类。第 一类由催化腺嘌呤的环外氨基的甲基化以形成产物N6-甲基腺嘌呤的氨基 甲基转移酶构成。第二类由催化胞嘧啶的环外氨基以形成产物N4-甲基胞 嘧啶的氨基甲基转移酶构成，而第三类由使胞嘧啶环上的5-碳原子甲基化 以形成5-甲基胞嘧啶的甲基转移酶构成。这些甲基化碱基在细菌R-M系统 中发挥重要功能，因为它们保护宿主染色体免受伙伴限制性酶的另外有害 作用，所述有害作用切割未经甲基化的识别序列DNA，但不作用于完全甲 基化的DNA。因此，正是DNA甲基转移酶及其同源限制性核酸内切酶的 组合作用保护细菌宿主免受任何未经修饰的外源DNA的影响。虽然R-M 系统发挥着重要的保护功能，但它们还抑制菌种之间甚至相同菌种的不同 菌株之间的质粒转移，因为单个细菌菌株内的多个R-M系统可全部参与限 制屏障。因此，R-M系统充当了多种细菌(包括在生物技术上具有重要性 的梭菌属(Clostridium))的基因操纵屏障。

梭菌属由多个具有宽泛的生物化学和生理性状的菌种构成。参见 Catoetal.,1986,GenusClostridium,pp.1141-1200,inP.H.Sneathetal.(eds.), Bergey’sManualofSystematicBacteriology,Vol.2,WilliamsandWilkins, Baltimore,MD(Cato等人，1986年，梭菌属，第1141-1200页，载于P.H. Sneath等人编，《伯杰氏系统细菌学手册》，第2卷，威廉斯和威尔金斯 出版公司，马里兰州巴尔的摩)。归类于梭菌属的分离株需要达到四个标 准：(1)能够形成内生孢子，(2)厌氧能量代谢，(3)不能发生异化硫酸盐还原 作用，以及(4)具有革兰氏阳性细胞壁。参见Andressonetal.,1989, IntroductiontothephysiologyandbiochemistryofthegenusClostridium,pp.27- 62,inMintonandClarke(eds.),Clostridia,PlenumPress,NewYork (Andresson等人，1989年，梭菌属的生理学和生物化学导论，第27-62 页，载于Minton和Clarke编，《梭菌》，普莱南出版社，纽约)。梭菌属 的产乙酸菌使用合成气作为碳源和在厌氧条件下生长的还原力。合成气由 H₂、CO和CO₂的混合物构成，它通过从城市废物到农业副产物的任何有机 材料的气化生成。由于合成气的低成本以及衍生来源的广泛性和灵活性， 使用合成气作为商品酶和化学品的生物性生产的原料具有很大的吸引力。 然而，相对而言，梭菌属中的产乙酸菌未得到鉴定，并且基因操纵(尤其 是通过引入稳定的且不被梭菌限制性核酸内切酶切割的异源核酸来基因操 纵)这些生物体的能力很大程度上未得到开发。转化梭菌的能力是梭菌有 效用于生成工业生物产物(例如，异戊二烯、丁二烯和乙醇)的第一个必 要和基本的步骤。