[发明专利]具有通用元件的基于荧光团的寡核苷酸探针

权利要求书

1.一种检测目的样品中靶多核苷酸的存在和/或靶多核苷酸内部序列变异的存在的方 法，包括步骤：

(i)提供包含两个独立的配偶体寡核苷酸组分的探针，所述两个独立的配偶体寡核苷 酸组分包括：

a)具有第一和第二区段的第一寡核苷酸，其中第一区段包含用至少一种目视可检测标 记物标记并且不能够与所述靶多核苷酸的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；并且其中第二区 段包含能够与所述靶多核苷酸的一部分序列杂交的核苷酸序列，第一寡核苷酸的所述第二 区段具有在25℃和50℃之间的解链温度(Tm)；和

b)具有第一和第二区段的第二寡核苷酸，其中第一区段包含能够与第一寡核苷酸的第 一区段的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；并且第二区段包含能够与靶多核苷酸的核苷酸序 列杂交的核苷酸序列，所述靶多核苷酸的核苷酸序列毗邻于第一寡核苷酸的第二区段能够 与之杂交的核苷酸序列，所述第二寡核苷酸的第二区段具有在40℃和70℃之间的解链温度 (Tm)；

(ii)使目的样品暴露于(i)的探针，从而在靶多核苷酸存在下，三重杂交事件可以发 生，所述三重杂交事件包括(a)第一寡核苷酸的第一区段与第二寡核苷酸的第一区段杂交； 和(b)第一寡核苷酸的第二区段和第二寡核苷酸的第二区段均与靶多核苷酸杂交；

(iii)检测目视可检测标记物的变化，其中目视可检测标记物的变化表示存在靶多核 苷酸和/或靶多核苷酸内部的序列变异；并且

(iv)使用解链曲线分析或复性曲线分析，分析目视可检测标记物的变化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中第一寡核苷酸用至少一种目视可检测标记物内部 标记。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中第一寡核苷酸具有15个至40个核苷酸残基之间 或20至30个核苷酸残基之间的长度；和/或第二寡核苷酸具有20个至50个核苷酸残基之间 或25个至40个核苷酸残基之间的长度。

4.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中第一和第二寡核苷酸的第二区段与之杂 交的靶多核苷酸的核苷酸序列具有15个至50个核苷酸之间或25个至40个核苷酸之间的长 度。

5.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中靶多核苷酸和/或靶多核苷酸内部的序 列变异仅在三重杂交事件已经发生后是可检测的。

6.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中第一寡核苷酸的第二区段和第二寡核苷 酸的第二区段与靶多核苷酸的连续序列杂交。

7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中第一寡核苷酸的第二区段和第二寡核 苷酸的第二区段与靶多核苷酸的非连续序列杂交。

8.根据前述任一项权利要求所述的方法，其中第一寡核苷酸的第二区段的解链温度 (T_m)在30℃和40℃之间；并且第二寡核苷酸的第二区段的T_m在50℃和60℃之间。

9.根据前述任一项权利要求的方法，其中第二寡核苷酸的第二区段的靶多核苷酸的解 链温度(T_m)大于第一寡核苷酸的第二区段的靶多核苷酸的T_m，以确保鉴定错配序列。

10.根据权利要求9所述的方法，其中第二寡核苷酸的第二区段的T_m比第一寡核苷酸的 第二区段高10℃。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中第二寡核苷酸的第二区段的靶多核 苷酸的T_m与第一寡核苷酸的第二区段的靶多核苷酸的T_m相同。