[发明专利]高催化活性的基因改造梭菌属神经毒素

说明书

本发明提供用于调节肉毒杆菌神经毒素及破伤风神经毒素的活性的方法。在一个实施例中，本发明提供具活性的破伤风神经毒素轻链(LC/T)和肉毒杆菌神经毒素轻链(LC/B)的衍生物，或具活性的整个破伤风神经毒素和肉毒杆菌神经毒素的衍生物。在另一个实施例中，本发明提供用于改善当前使用肉毒杆菌神经毒素的疗法的方法。在另一个实施例中，本发明提供应用肉毒杆菌神经毒素或肉毒杆菌神经毒素的轻链于各种治疗或美容用途的新颖方法。在一个实施例中，本发明提供的方法用于减少肉毒杆菌神经毒素于各种用途出现的免疫耐药性。

相关申请

本申请要求以2013年8月21日提交的美国临时专利申请号61/868,560为优先权基础，所述优先权文件的所有内容及公开都以引用方式被纳入本申请中。

本申请引用了多篇参考文献及出版物。所述参考文献及出版物的所有内容都以引用方式被纳入本申请中以便更能全面地描述与本发明相关的现有技术。

技术领域

本发明涉及包括肉毒杆菌神经毒素和破伤风神经毒素的梭菌属神经毒素的改造，以及这些神经毒素及其衍生物的用途。

背景技术

梭菌属神经毒素(Clostridia Neurotoxins,CNTs)是其中一种最毒害人类的蛋白毒素。 例如，肉毒杆菌神经毒素(Botulinum Neurotoxin,BoNT)会引起弛缓性麻痹并导致肉毒中 毒，破伤风神经毒素(Tetanus Neurotoxin,TeNT)则会引发痉挛性麻痹。梭菌属神经毒素的 分子量约150kDa,是一个具有典型A-B链-结构/功能特性的双链蛋白,其中B区域(结合区 域)与哺乳动物细胞的表面分子先结合，A区域(活性区域)随后转位至细胞内的位置(1). 梭菌属神经毒素由三个功能区域组成：N-末端的催化区域(轻链，LC)、中间的转运区 域(重链，HCT)及C-末端的受体结合区域(重链，HCR)(2)。梭菌属神经毒素属于锌 金属蛋白酶,能够切割SNARE蛋白(Soluble N-ethylmaleimide-Sensitive Factor AttachmentREceptor,可溶性NSF附着受体)，SNARE蛋白干扰突触小泡与质膜融合，最终阻止神 经细胞分泌神经传导物质(1,3)。哺乳动物神经元的胞吐作用是由一种SNARE蛋白质复合 物所带动，该蛋白质复合物由囊泡SNARE蛋白囊泡相关膜蛋白-2(vesicle associated membraneprotein-2,VAMP2)以及两种质膜SNARE蛋白，SNAP25(分子量为25kDa的 突触体相关蛋白Synaptosome-Associated Protein)和突触融合蛋白1a(syntaxin 1a)所形成 (4)。BoNT共有七个血清型(血清型A-G)能切割三种SNARE蛋白其中一种的某些特定 氨基酸残基：BoNT血清型B、D、F和G及TeNT能切割VAMP2，BoNT血清型A及E 能切割SNAP25，和BoNT血清型C能切割SNAP25和突触融合蛋白1a(3,5-7)。

BoNTs最被广泛使用于蛋白治疗。早在1989年，BoNT血清型A(BoNT/A)经美国 食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗斜视、眼睑痉挛、面肌痉挛，也可用于颈部肌 张力障碍、化妆品、眉间面部线条及腋窝多汗症。由于BoNT血清型A对治疗肌张力障 碍和其他与不随意肌活动有关的毛病有效，并且符合安全性，BoNT血清型A在眼科、胃 肠道科、泌尿外科、骨科、皮肤科、分泌及痛症各个领域已被批准作为实验性使用或药 品标示外使用(8-17)。FDA于2000年12月11日批准肉毒杆菌神经毒素血清型B (MYOBLOC^TM)用于治疗患有颈部肌张力障碍的患者，以减少与此病相关的头部位置异 常和颈部疼痛的严重性(18,19)。