[发明专利]用于控制多肽的α-酰胺化和/或C-末端氨基酸分裂的细胞培养基和方法

说明书

本发明涉及一种用于降低在细胞培养物中表达多肽的C‑末端异质性的细胞培养基，其中所述培养基包含至少一种有效量必需的微量元素，还涉及一种用于降低蛋白质的C‑末端异质性的细胞培养方法，所述方法中采用了必需的微量元素。

技术领域

本发明广泛地涉及细胞培养基组合物和细胞培养方法的技术领域。特别地，本发明是针对降低多肽，如糖蛋白的异质性。

背景技术

在哺乳动物细胞的重组蛋白的生产过程中，蛋白质的多个修饰是发生在表达后(即翻译后)，且因此导致重组蛋白产物的异质性。由于翻译后修饰并不是由蛋白质核苷酸序列编码进行编码，而是主要依赖于几个环境酶的作用，从而在生产过程中它们是难以控制并保持在严格(期望)的规格范围。因此特别是在重组治疗性蛋白的制造过程中，最大的挑战是保持蛋白质产物恒定的特性和质量。

在多肽的所有相关可能质量属性的综合列表内，C-末端α-酰胺化是归因于C-末端异质性的基团。重链上的C-末端赖氨酸(Lys)的处理是重组单克隆抗体(mAb)最常见的修饰之一。重链的C-末端Lys可以通过碱性羧肽酶(CP)的活性被完全地或部分地除去。通过128Da除去一个C-末端Lys残基降低了分子量，并通过1个单位增加了正电荷。部分地除去C-末端Lys残基导致(由于单克隆抗体(mAb)的四级结构)抗体的混合种群具有零个，一个或两个C-末端赖氨酸残基(Liu等人，2008)。在缺乏赖氨酸时，能够进一步去除第二氨基酸甘氨酸(Gly)，随后剩余的C-末端氨基酸脯氨酸(Pro)酶促地α-酰胺化。

C-末端α-酰胺化是公知的，并在多肽和蛋白质的生物活性中具有重大意义。许多神经肽需要C-末端α-酰胺化步骤以使其成熟为活性的受体结合分子。例如，神经毒素非酰胺化类似物较包括C-末端α-酰胺化脯氨酸(Pro)的神经毒素具有四倍较低活性。在人血浆中人免疫原性MART-1肽的稳定性因C-末端α-酰胺化显著增加。蛇毒C-末端α-酰胺化通过降低其蛋白质降解来增加其在溶液中的寿命，并导致与未修饰的肽相比，其具有更高的活性。四肽乙酰基-丝氨酸(Ser)-天冬氨酸(Asp)-赖氨酸(Lys)-脯氨酸(Pro)抑制人类和鼠原始造血细胞的增殖，且很容易通过血管紧张素I-转换酶(ACE)降解。其C-末端α-酰胺化类似物不能因ACE而降解，且其血浆水平比野生型肽高26倍。因此多肽的C-末端α-酰胺化增加了其固有的生物学和免疫学活性，以及稳定性。

C-末端α-酰胺化是专有的酶反应，由双功能肽酰甘氨酸α-酰胺化(PAM)酶催化。第一个步骤是：通过肽酰甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM，EC 1.14.14.3)域进行C-末端甘氨酸残基的α-羟基化。第二个步骤是：通过肽基α-羟基甘氨酸α-酰胺化分裂酶(PAL，EC4.3.2.5)域(Metha NM，2009)使α-羟基甘氨酸延长肽进行脱烷基化形成α-酰胺化肽和乙醛酸盐。进一步地，参见国际申请PCT/EP2011/069756或PCT/EP2013/057866，可以获悉PAM的酶促反应，该申请的全部公开内容在此引入本文。

在此背景下，实施了纯化PAM酶的多项研究以增加体外和体内的C-末端α-酰胺化。在这些研究中，揭示了多种不同的活化剂，抑制剂和辅因子。

EP0409294A1描述了一种充当PAM酶的辅因子的物质，其在高于225nm时没有吸收光谱，且不是肽，也不是茚三酮阳性物质，其具有小于1,000Da的分子量，在电渗析迁移到正极并具有两亲性结构。前述的抑制剂被用于多肽或蛋白质的C-末端α-酰胺化的制备(Gunther K,1990)。

另一个用于C-末端α-酰胺化的辅因子在GB2233978A中有描述。PAM酶的辅因子是具有式R–(C＝O)_n–(CHOR1)_n–CH₂OR2的化合物，其中R代表氢原子或烷基，R1和R2分别表示PO₃H₂或SO₃H基团(Gozzini等人,1991)。