[发明专利]新型修饰的鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用途

说明书

提供的是具有改进的腐胺生产力的新型修饰的鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用途。

技术领域

本公开内容涉及新型修饰的鸟氨酸脱羧酶蛋白和其用途。

背景技术

腐胺(或1,4-丁二胺)是用于生产包括尼龙-4、6在内的聚酰胺-4、6的重要原料，并且主要通过琥珀腈的加氢以工业规模生产，所述琥珀腈通过氰化氢的加成自丙烯腈产生。此化合物的化学合成需要不可再生的石油化学产品作为原料、和多步骤与多反应器设计中相对高的温度和压力、以及使用昂贵的催化剂体系。另外，因为这些原料是高毒性和易燃的，所以已知的化学合成工艺是不利于环境的。因此，作为化学生产工艺的替代选择，需要从源自可再生的生物质的碳源生产腐胺的方法。近来，通过环境友好的微生物生产腐胺的生化方法已经受到很多关注。腐胺是在从细菌到动物和植物范围的广谱的生物体中发现的一种多胺。大肠杆菌中腐胺的浓度已知为极其高，多达大约2.8g/L。同样地，微生物具有对高浓度多胺的潜在的良好抗性，并且因而它们能够在其高浓度的存在下生长和生存。例如，已经报道谷氨酸棒状杆菌甚至可以在大于30g/L的尸胺的存在下生长。因此，已经持续地进行研究以在可工业获得的高浓度多胺的生产中使用微生物。然而，对使用微生物生产多胺的研究还不足够先进而可工业应用。因此，需要开发出能够以高产量生产多胺的菌株(QianZG等，Biotechnol Bioeng,104:651-662,2009；Schneider J等，Appl MicrobiolBiotechnol,88:859-868,2010)。

同时，鸟氨酸脱羧酶(ODC)是在大多数微生物中发现的酶，其将鸟氨酸转化为腐胺。大肠杆菌中的ODC通常形成同型二聚体，并且在二聚体界面(dimerinterface)处形成活性位点。ODC的反应机制需要磷酸吡哆醛(PLP)作为辅助因子，并且PLP在酶的活性位点的赖氨酸残基处形成希夫碱，其随后被经历脱羧的底物鸟氨酸替换。当产生腐胺时，ODC再次与PLP形成希夫碱。

当ODC被引入产腐胺菌株——棒状杆菌属——时，其是由大肠杆菌speC基因编码的蛋白质，并且其活性被报道为非常低。因此，为了开发以高产量生产腐胺的菌株，ODC——其是参与腐胺生物合成途径的最后步骤的酶——的改进是非常重要的。至今，仅对ODC蛋白的结构或反应机制进行了突变研究，并且还没有关于其活性增加的报道。

发明内容

技术问题

本发明人已经做出了许多努力以改进ODC蛋白，其在腐胺的生产中发挥重要的作用但显示低活性。结果，本发明人发现了新型突变位点，并且在该位点上引入了突变以制备具有改进的产腐胺活性的修饰的ODC蛋白，并且他们发现当该修饰的ODC蛋白被引入产腐胺微生物时，微生物能够以高产量生产腐胺，从而完成本申请。

技术方案

本发明的目标是提供新型修饰的鸟氨酸脱羧酶(ODC)蛋白。

本发明的另一个目标是提供编码该修饰的ODC蛋白的多核苷酸、包括所述多核苷酸的载体和转化有所述载体的转化体。

本发明的仍另一个目标是提供制备腐胺的方法，所述方法包括以下步骤：使L-鸟氨酸、包含L-鸟氨酸的混合物或L-鸟氨酸发酵液与该修饰的ODC蛋白反应。

本发明的仍另一个目标是提供重组微生物，其通过改变为具有产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物中的修饰的ODC蛋白而具有改进的产腐胺活性。

本发明的仍另一个目标是提供生产腐胺的方法，所述方法包括以下步骤：培养通过引入修饰的ODC蛋白而具有改进的产腐胺活性的棒状杆菌属某种微生物；和从在上面的步骤中获得的培养物回收腐胺。

有益效果

根据本发明的修饰的鸟氨酸脱羧酶蛋白具有比天然形式高21倍的腐胺转化活性。当修饰的鸟氨酸脱羧酶蛋白被引入产腐胺菌株时，腐胺生产力显著地增加。因此，其可以作为已知的化学合成途径的替代选择，广泛地应用于腐胺的高效大批量生产。