[发明专利]用于在胱天蛋白酶抑制剂存在下无细胞蛋白合成的方法和装置

权利要求书

1.无细胞蛋白合成的方法，其包括使用核酸模板和真核细胞裂解物的 体外翻译反应，特征在于所述翻译反应是在胱天蛋白酶抑制剂的存在下进 行的。

2.权利要求1的方法，特征在于所述胱天蛋白酶抑制剂是氨基酸衍生 物或肽衍生物，所述氨基酸衍生物或肽衍生物包含作为胱天蛋白酶底物的 氨基酸或肽序列，特别是作为胱天蛋白酶1-14型中的一种或多种的底物的 氨基酸或肽序列，以及不可逆地或可逆地结合胱天蛋白酶的官能团，特别 是不可逆地或可逆地结合胱天蛋白酶1-14型中的一种或多种的官能团。

3.权利要求2的方法，特征在于所述胱天蛋白酶抑制剂包含氨基酸天 冬氨酸或者含氨基酸天冬氨酸的肽序列。

4.权利要求3的方法，特征在于所述氨基酸或肽序列选自由以下组成 的组：天冬氨酸、缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸(VAD)、天冬氨酸-谷氨酸-缬氨 酸-天冬氨酸(DEVD；SEQIDNo.1)、和酪氨酸-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸 (YVAD；SEQIDNo.2)。

5.权利要求1-4任一项的方法，特征在于所述胱天蛋白酶抑制剂包含 不可逆地结合所有胱天蛋白酶1-14型的甲基酮基团作为官能团，例如，氟 甲基酮(FMK)或氯甲基酮(CMK)。

6.权利要求2-4任一项的方法，特征在于所述胱天蛋白酶抑制剂代表 偶联至至少一个醛基的肽。

7.权利要求1-6任一项的方法，特征在于在反应混合物中，所述胱天 蛋白酶抑制剂以20μM至100μM、优选25μM至50μM的浓度存在。

8.权利要求1-7任一项的方法，特征在于所述真核细胞裂解物选自包 含以下的组：麦胚裂解物，昆虫细胞裂解物，特别是Sf2l细胞裂解物，网 状细胞裂解物，角化细胞裂解物，来自CHO细胞、Hela细胞、杂交瘤细胞 或培养的淋巴瘤细胞的细胞提取物。

9.权利要求1-8任一项的方法，特征在于所述细胞裂解物含有膜小泡。

10.权利要求9的方法，特征在于所述膜小泡与所述细胞裂解物源自相 同的细胞系。

11.权利要求1-10任一项的方法，特征在于所述方法在这样的装置中 进行，所述装置包含由透析膜所分隔的至少两个区室，其中翻译反应在至 少一个第一区室(反应区室)中发生，并且在所述翻译反应期间i)反应物 穿过透析膜从至少一个其它的区室(供应和排出区室)扩散出，进入所述 反应区室，以及ii)反应副产物穿过透析膜从所述反应区室扩散出，进入所 述供应和排出区室。

12.权利要求1-10任一项的方法，特征在于实现了至少30μg/ml、优 选至少50μg/ml、100μg/ml、或150μg/ml的最大蛋白产率。

13.胱天蛋白酶抑制剂在使用真核细胞裂解物进行蛋白合成的无细胞 连续方法中用于提高蛋白产率的用途。

14.权利要求13的用途，特征在于以μg/ml反应介质来计量的最大蛋 白产率至少提升了2倍，特别是至少5倍或10倍。

15.胱天蛋白酶抑制剂在使用真核细胞裂解物进行蛋白合成的无细胞 方法中用于提高所合成的蛋白的稳定性的用途。

16.权利要求15的用途，特征在于所述用于蛋白合成的无细胞方法至 少包括以下步骤：

a)在反应介质中通过体外翻译反应来合成目标蛋白，所述反应介质包 含编码目标蛋白的核酸模板、含有膜小泡的细胞裂解物、以及胱天蛋白酶 抑制剂；

b)将含有所合成的目标蛋白的膜小泡从所述介质分离；

c)将所分离的膜小泡转移至第二反应介质中，所述介质包含编码目标 蛋白的核酸模板、不含有膜小泡的细胞裂解物、以及胱天蛋白酶抑制剂， 在第二反应介质中于胱天蛋白酶抑制剂的存在下执行体外翻译反应，以及 从第二介质中分离含有提高量的所合成目标蛋白的膜小泡；

其中步骤c)可以重复一次或多次。