[发明专利]选择真核宿主细胞的选择载体和方法

权利要求书

1.一种表达载体或至少2个表达载体的组合，所述载体包括：

a) 编码突变叶酸受体作为选择性标记物的多核苷酸，其中所述突变叶酸受体是叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少的功能膜结合叶酸受体，且其中所编码的突变叶酸受体是源自人且包括在氨基酸位置中的由丙氨酸取代为亮氨酸的一个取代的突变叶酸受体α，所述位置在结构上或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO: 1所示成熟野生型人叶酸受体α序列的49位氨基酸；

b) 至少一种编码目标多肽的多核苷酸，

其中当向宿主细胞引入所述表达载体或至少2个表达载体的组合时，自所述宿主细胞分泌目标多肽。

2.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所编码的突变叶酸受体具有以下特征：

成熟的突变叶酸受体包括以下序列：

其中Xaa是亮氨酸。

3.如权利要求1所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其特征在于，所编码的突变叶酸受体包括以下序列：

其中Xaa是亮氨酸。

4.如权利要求1-3中任一项所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其额外包括编码参与叶酸代谢的选择性标记物的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码二氢叶酸还原酶。

5.如权利要求4所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其包括：

a)含编码突变叶酸受体的所述多核苷酸的表达盒，其中所编码的突变叶酸受体包括在结构上或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO: 1所示成熟野生型人叶酸受体α序列的49位氨基酸的位置处的丙氨酸被亮氨酸取代；

b)至少一个含编码目标多肽的多核苷酸的表达盒；和

c)含编码二氢叶酸还原酶作为选择性标记物的多核苷酸的表达盒。

6.如权利要求1-3中任一项所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其中：所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体，对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低，和/或其中所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体，对叶酸的结合亲和性降低。

7.如权利要求4所述的表达载体或至少2个表达载体的组合，其中：所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体，对5-甲基四氢叶酸盐的6S非对映异构体的结合亲和性降低，和/或其中所述突变叶酸受体相较野生型叶酸受体，对叶酸的结合亲和性降低。

8.活力取决于叶酸摄取的宿主细胞，包括

a)编码突变叶酸受体作为选择性标记物的引入多核苷酸，所述突变叶酸受体是叶酸结合亲和性相较野生型叶酸受体减少的功能膜结合叶酸受体，其中所编码的突变叶酸受体是源自人且包括氨基酸位置中丙氨酸被亮氨酸取代的一个取代的突变叶酸受体α，所述位置在结构上或通过氨基酸序列同源性对应于SEQ ID NO: 1所示成熟野生型人叶酸受体α序列的49位氨基酸，

和

b)至少一种编码目标多肽的引入多核苷酸，

其中所述目标多肽分泌自所述活力取决于叶酸摄取的宿主细胞，且所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述突变叶酸受体具有一种或多种如权利要求1-3和6中任一项所定义的特征。

10.如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求1-7中一或多项所定义的表达载体或至少2个表达载体的组合。

11.如权利要求8-10中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞具有一种或多种以下特征：

a)表达内源叶酸受体；

b)包括引入多核苷酸，所述多核苷酸编码参与叶酸代谢的选择性标记物；和/或

c)引入多核苷酸稳定整合入基因组内。

12.如权利要求11所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是啮齿类动物细胞。