[发明专利]核酸酶概况分析系统

权利要求书

1.一种用于鉴定核酸酶的靶位点的方法，该方法包括：

(a)提供切割双链核酸靶位点的核酸酶，其中对所述靶位点的切割产生包含5′磷酸模块的经切割的核酸链；

(b)使(a)的核酸酶与候选核酸分子的文库在以下条件下接触，所述条件适合所述核酸酶在所述核酸酶的核酸酶靶位点处切割候选核酸分子以形成经切割的末端，其中每个候选核酸分子包含序列的多联体，所述序列包含候选的核酸酶靶位点和至少10个且不超过80个核苷酸的恒定的插入序列；和

(c)鉴定在(b)中被所述核酸酶切割的核酸酶靶位点，其通过以单读段通量从所述经切割的末端对在步骤(b)中被所述核酸酶切割的核酸链上的未切割的核酸酶靶位点直接测序来进行。

2.权利要求1的方法，其中所述经切割的末端是平末端。

3.权利要求1的方法，其中所述经切割的末端具有5′突出。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中步骤(c)包括经由5′-磷酸依赖性连接将第一核酸接头连接至所述经切割的末端。

5.权利要求4的方法，其中所述核酸接头以双链形式提供。

6.权利要求5的方法，其中所述5′-磷酸依赖性连接是平端连接。

7.权利要求4-6中任一项的方法，其中所述方法包括在将所述第一核酸接头连接至所述经切割的末端之前填补5′突出。

8.权利要求4-7中任一项的方法，其中步骤(c)进一步包括使用与所述接头杂交的PCR引物和与所述恒定插入序列杂交的PCR引物经由PCR反应扩增被核酸酶切割的多联体的片段，该片段包含未切割的靶位点。

9.权利要求8的方法，其中所述方法进一步包括对所述扩增的核酸分子富集包含单个未切割靶序列的分子。

10.权利要求9的方法，其中所述富集包括大小分级。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述候选核酸分子的文库包含至少10⁸、至少10⁹、至少10¹⁰、至少10¹¹或至少10¹²个不同的候选核酸酶切割位点。

12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述核酸酶是治疗性核酸酶，其切割与疾病有关的基因中的特定核酸酶靶位点。

13.权利要求12的方法，其进一步包括测定所述治疗性核酸酶切割该特定的核酸酶靶位点且不切割超过10、超过5、超过4、超过3、超过2、超过1个或无另外的核酸酶靶位点的所述治疗性核酸酶的最大浓度。

14.权利要求13的方法，其进一步包括将所述治疗性核酸酶以有效生成等于或低于所述最大浓度的最终浓度的量施用给受试者，其中所述受试者不是人类。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述核酸酶是与RNA分子形成复合物的可RNA编程的核酸酶，且其中该核酸酶:RNA复合物特异性结合与所述RNA分子的序列的一部分互补的核酸序列。

16.权利要求15的方法，其中所述RNA分子是单导引RNA(sgRNA)。

17.权利要求16的方法，其中所述sgRNA包含与所述核酸酶靶位点互补的15-25、19-21或20个核苷酸。

18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述核酸酶是Cas9核酸酶。