[发明专利]利用包含含蛋白膜囊泡的抗原组合物制备多克隆抗体的方法

说明书

本发明涉及一种制备针对抗原靶蛋白的多克隆抗体的方法，所述方法包括通过向宿主施用包含并入所述抗原靶蛋白的膜囊泡的免疫原性组合物来在所述宿主中诱导免疫反应，以及从所述宿主血清获得针对所述靶蛋白的抗体。这种方法的更具体的实施方式至少包括以下步骤：a)通过体外翻译反应在反应介质中合成所述靶蛋白，所述反应介质包含编码所述靶蛋白的核酸模板和含有膜囊泡的细胞裂解物；b)从所述介质分离包含所合成的靶蛋白的膜囊泡；c)在生理上相容的介质中提供包含所合成的靶蛋白的膜囊泡；d)向宿主施用步骤c)的膜囊泡；e)测试所述宿主的血清样品针对所述靶蛋白的特异性免疫反应；以及f)从表现出针对所述靶蛋白的特异性免疫反应的宿主的血清获得针对所述靶蛋白的特异性抗体。

背景技术

在诊断学和治疗学中抗体是强大和非常宝贵的工具。根据高特异性抗体的需求不断增长，随着时间已开发许多不同策略以允许可靠地生产足量的抗体(参见例如，J.S.Haurum,Drug Discovery Today,2006.11(13-14),655-660)。在这种背景下，1975年杂交瘤技术的发现代表重大突破，因为小鼠杂交瘤是单克隆抗体的第一种可靠来源。

在理论上，可以针对选定的任何靶标开发单克隆抗体。选定的靶标的提供是绝对必要的。即使在基因免疫的情况下，也需要抗原用于筛选和证实目的。不幸的是，在某些情况下，如果在基于细胞的测定中抗原分离或制备均不成功，则抗原的提供可能成为问题。

通常，抗原属于蛋白和肽的类别，但是原则上其他物质类别也可以用作免疫原，例如多糖、脂质和多核苷酸。在大多数情况下，应当针对天然抗原产生抗体。如果抗原是通过重组DNA技术产生的，则比较所得的重组蛋白或肽与其天然对应物的特性是非常重要的，因为蛋白结构的差异可以导致免疫原性的差异。对于抗体制备，蛋白和肽是高度感兴趣的靶标。鉴于免疫原性表位是线性的且不依赖于完整蛋白的三级结构的事实，肽合成代表基于细胞的表达的另一种选择。在另一方面，肽合成具有其局限性，因为蛋白和肽具有翻译后修饰(PTM)，这是三维表位的部分。此外，使用肽和肽混合物作为抗原可以诱导产生交叉反应性抗体。

膜蛋白占所有测序的基因组的近三分之一。与它们在细胞过程如信号传导、代谢、转运和识别中的重要参与相反，关于膜蛋白结构和功能性可获得的信息很少。在体内它们生物学活性的下调可以导致严重疾病，使得它们成为高度感兴趣的药理学靶标。这种发展引起对膜蛋白特异性抗体的需求增加。

针对膜蛋白的特异性抗体的产生常受到不能制备或分离某种靶膜蛋白的限制。在体内过量表达膜蛋白常受到蛋白错误折叠、不溶性、聚集、低产率和细胞毒性的妨碍。但是，膜蛋白的无细胞表达可以克服这些障碍。

在过去的十年里，无细胞蛋白合成已成为制备包括膜蛋白、胞质蛋白或甚至毒性蛋白在内的不同蛋白类别的有价值的工具(参见例如，Katzen etal.,TrendsBiotechnol.,2005.23(3),150-156)。高效无细胞表达系统的基础是具翻译活性的细胞提取物，其包含翻译的必要组分如核糖体、翻译因子和酶。此外，细胞裂解物补充了氨基酸、ATP和GTP和能量再生系统(例如肌酸-磷酸/肌酸-激酶能量-再生系统)。靶蛋白的合成通过添加DNA或mRNA形式的适当模板来起始。到目前为止，已在原核和真核无细胞系统中表达许多不同类型的功能活性靶蛋白。与原核细胞提取物相比，真核细胞裂解物在表达需要翻译后修饰的复杂蛋白中提供几个优势。

然而，使用通过原核和真核细胞裂解物合成的蛋白根据现有技术的常规方法制备特异性抗体仍涉及额外的费力的纯化和/或分离步骤，以便提供合适形式的期望靶蛋白用作免疫原性物质。

鉴于现有技术的缺点，本发明的主要目的是提供改进的方法和手段用于制备针对特定靶蛋白的多克隆抗体。

这个目的已通过提供制备针对特定靶蛋白的多克隆抗体的新方法实现，所述方法利用包含权利要求1和2的含蛋白膜囊泡的抗原组合物进行制备。本发明的其他方面和更多具体实施方案是其他权利要求的主题。

发明内容