[发明专利]生产色谱材料的方法

说明书

发明领域

本发明涉及一种用于生产色谱材料的方法。更确切地，本发明涉及一种通过色谱 颗粒表面改性生产反相色谱(RPC)材料的方法。

发明背景

吸附色谱取决于溶质分子和化学接枝到色谱基体的特定设计的配体之间的化学相互 作用。多年来，利用从电子电荷到生物亲和力的多种生化特性，已将许多不同类型的配体固 定到色谱载体用于生物分子纯化。对用于生物分子制备色谱的吸附技术范围的一种重要补 充是反相色谱，其中流动相溶质结合至固定的正烷基烃或芳族配体经由疏水性相互作用发 生。反相色谱在生化分离和纯化领域内具有分析和制备两种应用。具有一定程度疏水特性 的分子，例如蛋白质、肽和核酸，可通过反相色谱以优良的回收率和分解度分离。此外，流动 相中的离子配对修饰剂允许带电溶质（例如完全脱保护的低聚核苷酸和亲水肽）的反相色 谱。制备型反相色谱应用于从蛋白质片段微纯化用于测序到重组蛋白质产物的生产规模纯 化。

反相色谱的分离机制取决于流动相中的溶质分子和固定的疏水配体即固定相之 间的疏水性结合相互作用。疏水性结合相互作用自身的实际特性是激烈争论的问题，但常 规知识假定结合相互作用是有利的熵效应的结果。用于反相色谱的初始流动相结合条件主 要为水性的，这表明在溶质分子和固定配体两者周围的高度组织化水结构。在溶质结合到 固定的疏水配体时，暴露于溶剂的疏水面积最小化。因此，组织化水结构的程度随着相应的 系统熵的有利增加而减小。以这种方式，从能量观点来看，疏水部分即溶质和配体缔合是有 利的。

反相色谱是实验设计的吸附方法，其依赖于影响分离的分配机制。溶质分子在流 动相和固定相之间分配(即建立平衡)。溶质在两相之间的分布取决于介质的结合性质、溶 质疏水性和流动相组成。初始，实验条件设计成有利于溶质从流动相吸附至固定相。随后， 改变流动相组成以有利于溶质从固定相脱附回到流动相中。在这种情况下，认为吸附是溶 质分子分布基本上100%在固定相内的极端平衡状态。相反地，脱附是溶质基本上100%分布 在流动相内的极端平衡状态。

生物分子反相色谱通常使用梯度洗脱而不是等度洗脱。虽然生物分子在水性条件 下强烈吸附于反相基体表面，但它们在非常窄的有机修饰剂浓度窗内从基体脱附。连同这 些具有其独特吸附性质的高分子量生物分子，典型的生物试样通常含有宽的生物分子混合 物，具有相应多样化的吸附亲和力范围。因此，用于复杂生物试样反相分离的唯一实用方法 为梯度洗脱。

总之，反相色谱中的分离取决于具有不同程度疏水性的溶质分子对疏水固定相的 可逆吸附/脱附。

色谱过程中的第一步为在适合的初始流动相条件下使被反相介质填充的柱平衡， 所述流动相条件为pH、离子强度和极性(流动相疏水性)。通过添加有机修饰剂例如乙腈来 控制流动相的极性。离子配对剂例如三氟乙酸也可能是适当的。初始流动相(通常称为流动 相A)的极性必须低得足以溶解部分疏水的溶质，但高得足以保证溶质结合到反相色谱基 体。在第二步骤中，施用包含要分离的溶质的样品。理想地，将样品溶于用于使色谱床平衡 的相同流动相中。以发生最优结合的流速将样品施用于柱。一旦施用样品，进一步用流动相 A洗涤色谱床，以去除任何未结合和不需要的溶质分子。

结合的溶质随后通过调节流动相的极性从反相介质脱附，使得结合的溶质分子连 续脱附并从柱洗脱。在反相色谱中，这通常包括通过增加有机修饰剂在流动相中的百分比 来降低流动相的极性。这通过维持最终流动相(流动相B)中有机修饰剂的高浓度来实现。通 常，初始和最终流动相溶液的pH保持相同。通过从含有极少或没有有机修饰剂的100%初始 流动相A到含有较高有机修饰剂浓度的100%(或更少)流动相B的增加线性梯度，实现流动相 极性的逐渐下降(增加流动相疏水性)。根据其各自的疏水性，结合的溶质从反相介质脱附。

过程中的第四步骤包括去除先前未脱附的物质。这通常通过将流动相B改变到接 近100%有机修饰剂以保证在再使用柱之前完全去除全部的结合物质来实现。

第五步骤是色谱介质从100%流动相B回到初始流动相条件的再平衡。

反相色谱中的分离是由于存在于样品中的溶质的不同结合性质(因为它们疏水性 质的差异)。可通过操纵初始流动相的疏水性质，控制溶质分子结合至反相介质的程度。虽 然溶质分子的疏水性难以定量，但容易实现其疏水性质仅轻微变化的溶质的分离。因为其 优良的分解能力，反相色谱是用于复杂生物分子高性能分离的不可缺少的技术。