[发明专利]siRNA及其在用于抑制ORAI1基因表达的方法和组合物中的应用

说明书

发明领域

本发明涉及这样的领域：siRNA产品及其在用于治疗和/或预防眼病的方法和组合物中的用途，所述方法和组合物更具体地用于治疗和/或预防诸如结膜炎和/或眼睛变态反应的眼病，所述眼病与高水平的ORAI1表达和或活性相关。

发明背景

RNA干扰(RNAi)是存在于大多数真核细胞中的天然存在的转录后调控机制，其使用小双链RNA(dsRNA)分子以指引依赖于同源性的基因沉默。Fire和Mello在蠕虫线虫(C.elegans)中的该发现{Fire，1998}获得了2006年的诺贝尔奖。在对其首次描述后不久，也显示RNAi发生在哺乳动物细胞中，不是通过长的dsRNAs而是通过21个核苷酸长的双链小干扰RNA(siRNAs)进行{Elbashir，2001}。

据信RNA干扰的过程是在进化上保守的细胞防御机制，用于防止外源基因的表达，并且为不同门(phyla)和区系(flora)所共有，其中它被称为转录后基因沉默。自从发现RNAi机制，已经进行了大量研究，用于发现能够选择性地改变基因表达的新的化合物，其通过处理这样的靶标而作为治疗人类疾病的新途径，所述靶标是利用涉及小分子或蛋白质的常规药物方法“不能用药”的。

根据现有知识，RNAi的机制始于由称为切酶(Dicer)的RNA酶III样蛋白质处理长的双链RNAs之时。蛋白质切酶通常包含N端RNA解旋酶结构域，结合RNA的所谓Piwi/Argonaute/Zwille(PAZ)结构域，两个RNA酶III结构域和双链RNA结合结构域(dsRBD){Collins，2005}，并且它的活性导致长的双链RNAs被加工为21-24个核苷酸的双链siRNAs，该双链siRNAs具有2个碱基的3'突出端和5'磷酸和3'羟基。所得的siRNA双链体然后结合到称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的效应物复合物 中，其中在双链siRNA分子通过RNA解旋酶活性的三磷酸腺苷(ATP)依赖性解旋时{Nykanen，2001}，siRNA的反义或导引链指导RISC识别并切割目标mRNA序列{Elbashir，2001}。导致mRNA降解的RISC的催化活性由核酸内切酶Argonaute 2(AGO2)介导{Liu，2004；Song，2004}。AGO2属于高度保守的Argonaute蛋白质家族。Argonaute蛋白质是～100KDa的高碱性蛋白质，其包含两个共同的结构域，即PIWI和PAZ结构域{Cerutti，2000}。PIWI结构域对于与切酶的相互作用是关键的，并且包含负责切割mRNAs的核酸酶活性{Song，2004}。AGO2使用siRNA双链体中的一条链作为指导去找到含互补序列的信使RNAs并在相对于指导链的5'端的第10和第11个碱基之间切割磷酸二酯骨架{Elbashir，2001}。RISC活化期间的一个重要步骤是由AGO2切割正义或信使链，将此链从复合物中去除{Rand，2005}。分析siRNA指导链和PIWI结构域之间相互作用的晶体学研究表明仅第2至第8个核苷酸构成指导RISC识别目标mRNA的“种子序列(seed sequence)”，并且此序列中单个核苷酸的错匹配可以显著影响所述分子的沉默能力{Ma，2005；Doench 2004；Lewis，2003}。一旦mRNA已经被切割，由于片段中不受保护的RNA末端的出现，mRNA被细胞内的核酸酶进一步切割和降解，并且将不再被翻译为蛋白质{Orban，2005}，同时RISC将再循环用于随后的若干轮{Hutvagner，2002}。这构成了导致特定mRNA分子及相应的蛋白质的选择性减少的催化过程。可能利用基因沉默的这种天然机制从而通过直接将siRNA效应物递送到细胞或组织中来调控任何所选的基因，在所述细胞或组织中它们将活化RISC并且产生被靶向的mRNA的有效且特异性的沉默。RNAi已经用于生物医学研究，诸如HIV、病毒性肝炎、心血管病和脑血管病、代谢病、神经变性病症和癌症的治疗{Angaji SA等2010}。