[发明专利]可变换CAS9核酸酶及其用途

说明书

本公开内容的一些方面提供了用于控制RNA可编程内切核酸酶(诸如Cas9)的活性和/或改善RNA可编程内切核酸酶(诸如Cas9)的特异性的组合物、方法、系统和试剂盒。例如，提供了工程化改造为以“开启”或“关闭”状态存在的引导RNA(gRNA)，其控制RNA可编程内切核酸酶的结合以及因此切割活性。本公开内容的一些方面提供了mRNA感测性gRNA，其基于靶mRNA的存在或缺乏调控RNA‑可编程内切核酸酶的活性。本公开内容的一些方面提供了gRNA，其基于延长的DNA(xDNA)的存在或缺乏调控RNA‑可编程内切核酸酶的活性。

相关申请

本申请要求2014年7月8日提交的美国申请U.S.S.N.14/326,329，2014年7月8日提交的美国申请U.S.S.N.14/326,340，和2014年7月8日提交的美国申请U.S.S.N.14/326,361的在35U.S.C.§365(c)下的优先权，而且还要求2013年9月6日提交的美国临时申请U.S.S.N.61/874,682的在35U.S.C.§119(e)下的优先权，每篇通过提及并入本文。

发明背景

位点特异性内切核酸酶在理论上容许靶向操作基因组内的单一位点，并且在基因靶向的背景中以及对于治疗应用是有用的。在多种生物体(包括哺乳动物)中，位点特异性内切核酸酶已经用于通过刺激非同源末端连接或同源重组来进行基因组工程。在提供有力的研究工具外，位点特异性核酸酶还具有作为基因治疗剂的潜力，并且两种位点特异性内切核酸酶最近已经进入临床试验：一种(即CCR5-2246)靶向人CCR-5等位基因作为抗HIV治疗办法的一部分(NCT00842634,NCT01044654,NCT01252641)，和另一种(VF24684)靶向人VEGF-A启动子作为抗癌治疗办法的一部分(NCT01082926)。

在没有脱靶活性或仅具有最小脱靶活性的情况中对意图核酸酶靶位点的特异性切割是位点特异性内切核酸酶的临床应用，和还是基础研究应用中的高效率基因组操作的前提。例如，工程化位点特异性结合域的不完全特异性已经与除了意图靶物外的基因组基因座的不想要变化和细胞毒性联系起来。然而，目前可用的大多数核酸酶展现出相当大的脱靶活性，并且如此可能不适合于临床应用。一种在临床和研究背景中使用的出现的核酸酶平台是RNA引导性核酸酶，诸如Cas9。虽然这些核酸酶能够结合引导指导特异性靶位点切割的RNA(gRNA)，但是仍对某些Cas9:gRNA复合物观察到脱靶活性(Pattanayak et al.,“High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmedCas9 nuclease specificity.”Nat Biotechnol.2013；doi:10.1038/nbt.2673)。因此，需要将核酸酶工程化改造为具有改善的特异性的技术。

发明概述

本公开内容的一些方面基于下述认识，即一些工程化位点特异性内切核酸酶的报告的毒性基于脱靶DNA切割。此外，一般不能在分子水平上控制存在的RNA引导性核酸酶的活性，例如，以将核酸酶从“关闭”转换成“开启”状态。控制核酸酶的活性可以降低招致脱靶效应的可能性。本公开内容的一些方面提供了控制RNA-可编程内切核酸酶(诸如Cas9内切核酸酶)的结合和/或切割活性的策略、组合物、系统和方法。

因而，本公开内容的一个实施方案提供了RNA引导性核酸酶复合物，其包含“可变换”引导RNA(gRNA)。例如，在一些实施方案中，本发明提供了复合物，其包含：(i)包含适体的gRNA，其中gRNA在缺乏与适体结合的特定配体的情况中不与靶核酸杂交；和(ii)Cas9蛋白。在一些实施方案中，适体由配体结合。在一些方面中，配体是任何分子。在一些方面中，配体是小分子、代谢物、碳水化合物、肽、蛋白质或核酸。在一些实施方案中，gRNA:配体:Cas9复合物结合靶核酸并且介导靶核酸的切割。参见例如图1。