[发明专利]用于对酮修饰的多肽类进行肟缀合的方法

说明书

本发明提供由酮修饰的蛋白质制备蛋白质缀合物的方法。在一个实施方案中，通过经与1,3‑二卤代丙酮或类似含酮的反应剂反应连接两个游离半胱氨酸、而将两个半胱氨酸的硫原子连接在一起来制备该蛋白质。然后将硫原子之间插入的酮用于形成肟，由此将所述蛋白质缀合于有效负荷。在另一个实施方案中，通过与1,3‑二卤代丙酮或类似反应剂反应来将两个半胱氨酸联结在一起，并且新的酮用于与适合的有效负荷分子形成肟。该方法为肟形成提供了改进的反应条件，由此得到高收率和改善的产物均匀性。

背景

已经将各种化学结构部分(‘有效负荷’)与酶、抗体和其它大的多肽类或蛋白质连接，形成缀合物。有效负荷可以用于定位它们所连接的蛋白质(例如标记)，以改变该蛋白质的理化特性或稳定性(例如聚乙二醇化)，从而能够使得该蛋白质连接至另一个分子或蛋白质(用于使缀合物连接至另一种化合物或另一种缀合物的偶联基团)或改变所述有效负荷或蛋白质的功能或活性(例如疫苗缀合物)。蛋白质还可以作为载体起作用以便将连接的有效负荷递送至特定的组织或细胞类型，例如以抗体-药物缀合物(ADC)的形式。可以有用地连接至蛋白质的有效负荷的类型包括可检测的部分(标记)、使蛋白质连接至表面或另一种化合物的锚定结构部分、在与蛋白质缀合时引起免疫应答的抗原、易于与化学互补偶联配偶体反应的偶联基团(由此使蛋白质连接至另一种实体)和治疗结构部分，例如细胞毒素和另外的生物活性剂。使这些不同的结构以可控和可再现的方式连接至蛋白质通常对于缀合物正确地起作用而言是关键的。因此，对于使许多类型的有效负荷连接至许多不同的蛋白质或多肽类的各种方法存在需求。

已经研发了大量用于使有效负荷连接至蛋白质以形成蛋白质缀合物的方法。参见，例如Sletten,E.M.和Bertozzi,C.R.Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,6974–6998；Basle′,E.；Joubert,N.；和Pucheault,M.Chemistry&Biology 2010,17,213-227。在一些蛋白质缀合物中，连接蛋白质和有效负荷的方法可能对缀合物的活性或相关特性具有不可预测的影响；在另外的情况中，蛋白质与有效负荷之间的连接基团的性质可以显著地影响缀合物的活性或特性。有时，关键在于，例如控制每个蛋白质中有效负荷结构部分的数量，或控制其中连接有效负荷的精确的位置，以便它们不干扰蛋白质的功能。例如，ADC需要蛋白质识别并且结合靶细胞上的表面结构，以便传递选择性，由此有效负荷不得定位于干扰抗体结合该抗体必须识别的表面结构(抗原)的位置。参见，例如Expert Opin.Biol.Ther.2012,12,1191-1206；Toxins 2011,3,848-883；和Laurent Ducry Drug Delivery in Oncology：From Basic Research to Cancer Therapy,第1版.Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KGaA.2012,12,355-374。

大部分连接有效负荷与蛋白质的方法包括在蛋白质与所关注的特定有效负荷之间添加连接化学结构(连接基)。连接基提供使用每个结构部分上可利用的官能团来使所关注的有效负荷连接至蛋白质的方式。连接基通常允许有效负荷与要调节的蛋白质之间存在一定距离，并且还可以包括可以在体内被裂解或降解以便从蛋白质中释放有效负荷的可裂解的部分，其中释放对于有效负荷实现其目的是重要的。例如，在ADC中，对于缀合物而言关键在于在有效负荷能发挥期望的作用的位置上分解并且释放有效负荷。由于不同类型的蛋白质-有效负荷缀合物对连接有效负荷和蛋白质的方式提出不同要求，所以对于使有效负荷持续地和有效地连接至蛋白质的新方法存在持续的需求。