[发明专利]一种接头元件和使用其构建测序文库的方法

说明书

提供了一种接头元件和使用该接头元件构建测序文库的方法，所述接头元件由接头A和接头B组成；接头A由一条核酸长链与一条核酸短链互补配对而成，长链5’端具有磷酸修饰，短链3’端为封闭修饰，短链中具有酶作用位点；接头B为一条核酸单链，其3’端能与接头A长链5’端互补配对。使用本发明的接头元件构建测序文库时，在保证接头连接方向性的同时，解决了片段互连、接头自连、连接效率低的问题，减少了步骤间的纯化反应，缩短了连接时间，降低了成本。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种接头元件，使用该接头元件构建测序文库的方法，所构建的测序文库及其应用。

背景技术

高通量测序已经成为了现代分子生物学、生物技术、医学等多领域的基础之一。在近几年，对迅速、精确、经济的基因表达水平和核苷酸序列的测定方法的研究不断推陈出新；以边合成边测序为基本原理的第二代高通量测序技术已趋于成熟，各大测序公司纷纷将重点放在了新测序产品的开发、测序流程的缩短和成本降低上。目前已有的基于第二代测序技术的测序产品有全基因组重测序、全转录组测序、小分子RNA测序等。特别的，第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术能够使用大量寡核苷酸探针与基因组上的特定区域互补结合，捕捉富集特定区段的基因片段进行测序；运用于疾病基因的检测诊断与研究。

Complete Genomics(CG)公司目前已有一套独立自主开发的第二代测序技术，适用于人全基因组测序。其文库构建流程主要包括：基因组DNA打断、第一次接头连接、双链环化并酶切、第二次接头连接、单链分离环化。其中两次接头连接在整个建库流程非常重要。接头是一段特殊的设计好的DNA序列，通过连接等方法固定在DNA片段两端后，在测序时能被识别并作为测序的起始位点，供仪器读取其后的序列信息。为保证读取的序列信息易于分析，在一个DNA片段的两端(5’端和3’端)需要加上两种不同的接头；为了实现这种特定的方向性连接，同时避免接头间的相互连接，可以采用粘性末端接头连接的方式；但这种方式要求具有粘性末端的片段，难以避免片段间相互连接的问题。而Complete Genomics公司测序文库构建则采用了分多步骤分别添加两端接头的方式。为获得两端均连接上接头的片段，需要经过DNA片段一端连接接头、变性退火延伸、在DNA片段另一端连接接头、缺口补平、聚合酶链式反应在内五个步骤。其中多次的延伸反应所需试剂费用高昂，步骤间需要进行多次纯化回收，总体成本高且缺乏效率。

为解决Complete Genomics公司测序平台文库构建中存在的接头连接步骤过多，整体文库构建时间过长，成本过高的问题，特提出了本发明。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种接头元件，使用该接头元件构建测序文库的方法，所构建的测序文库及其应用。本发明的构建测序文库的方法，在接头连接时抛弃了传统的多步骤分别添加两端接头的方式，通过有着独特的序列构造的连接接头，和同样新颖的接头连接+单链替换的接头连接方法，在保证接头连接方向性的同时，解决了片段互连、接头自连、片段连接效率低的问题，并成功地将整个接头连接过程简化为四个全新步骤，并减少了步骤间的纯化反应，大大缩短了接头连接所需时间，明显地降低了成本；此外，本发明的测序文库构建方法还引入了核酸探针捕获技术，从而实现目标基因组区域的测序，成功创立了基于单链环状文库测序平台的目标区域捕获测序产品。

第一方面，本发明提供了一种接头元件，该接头元件由接头A和接头B组成；所述接头A由一条核酸长链与一条核酸短链互补配对而成，其长链5’端具有磷酸修饰，其短链3’端为封闭修饰，其短链中具有酶作用位点；所述接头B为一条核酸单链，其3’端能与接头A长链5’端互补配对，其余部分则无法与接头A互补配对。

上述接头元件中，作为优选，所述接头A长链为40-48bp，接头A短链为9-14bp；

优选地，所述接头B中，与接头A长链互补的长度为6-12bp，与接头A长链不互补的长度为9-15bp；

优选地，所述封闭修饰为双脱氧封闭修饰。