[发明专利]一种转座酶打断核酸并加接头的方法和试剂

权利要求书

1.一种转座酶打断核酸并加接头的方法，包括如下步骤：

使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，其中所述转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头，打断的核酸两端连接所述第一接头并且形成缺口；

通过化学试剂处理的方式使转座酶变性或消化而从靶序列上解离下来，去除体系中的转座酶对后续反应的影响，所述化学试剂包括第一试剂和第二试剂；其中，所述第一试剂包括NT缓冲液，用于打破所述转座酶与所述核酸的靶序列的吸附作用；所述第二试剂包含Triton-X100溶液，用于减弱所述第一试剂对后续酶促反应的影响；

使用连接酶在所述缺口处连接上第二接头，所述第二接头的序列不同于所述第一接头；

使用分别靶向结合所述第一接头和所述第二接头的引物进行PCR反应，得到两端分别连接有不同接头序列的产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一接头上带有防止自连或与所述第二接头互连的修饰。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一接头上的修饰方式包括如下任一种或多种的组合：

（a）所述第一接头的3’端碱基双脱氧修饰；

（b）所述第一接头的一条链中引入dUTP，用于之后的USER酶切过量接头；

（c）所述第一接头的转座酶识别序列外侧引入一个碱基对，其中3’端碱基双脱氧修饰；和

（d）所述第一接头由一条完整序列组成，内部互补形成一段3’-5’磷酸二酯键交联的双链序列。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一接头上的修饰方式为所述第一接头的3’端碱基双脱氧修饰。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二接头上带有防止自连的修饰。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第二接头上的修饰为3’端碱基双脱氧修饰。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR反应使用的引物中的一条引物是末端生物素标记的引物，用于通过生物素-链霉亲和素亲和反应而获取单链分子。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一试剂还包括含有EDTA的附加试剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二试剂还包含吐温-20溶液。

10.一种转座酶打断核酸并加接头的试剂，包括如下组成部分：

转座酶和含转座酶识别序列的第一接头，用于形成转座酶包埋复合体以对核酸进行随机打断，在打断的核酸两端连接所述第一接头并且形成缺口；

第一试剂和第二试剂，所述第一试剂包括NT缓冲液，用于打破所述转座酶与所述核酸的靶序列的吸附作用，所述第二试剂包含Triton-X100溶液，用于减弱所述第一试剂对后续酶促反应的影响；

第二接头和连接酶组分，用于在所述缺口处连接上第二接头；和

PCR引物，分别靶向结合所述第一接头和所述第二接头，用于进行PCR反应，得到两端分别连接有不同接头序列的产物。

11.根据权利要求10所述的试剂，其特征在于，所述第一接头上带有防止自连或与所述第二接头互连的修饰。

12.根据权利要求11所述的试剂，其特征在于，所述第一接头上的修饰方式包括如下任一种或多种的组合：

（a）所述第一接头的3’端碱基双脱氧修饰；

（b）所述第一接头的一条链中引入dUTP，用于之后的USER酶切过量接头；

（c）所述第一接头的转座酶识别序列外侧引入一个碱基对，其中3’端碱基双脱氧修饰；和

（d）所述第一接头由一条完整序列组成，内部互补形成一段3’-5’磷酸二酯键交联的双链序列。