[发明专利]一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂

说明书

一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂，该方法包括：将核酸打断成核酸片段；连接第一接头序列；扩增得到两端具有第一接头序列的第一产物，其中引物序列上具有U碱基；用USER酶酶切第一产物，环化产生缺口；或引物序列上还具有切口酶识别序列，用USER酶酶切第一产物，环化并使用切口酶酶切产生切口；从切口或缺口处进行限制性切口/缺口平移反应；消化除去未发生限制性切口/缺口平移反应的部分；连接第二接头序列；扩增得到两端具有第二接头序列的第二产物；变性第二产物，并使用介导序列对单链核酸分子进行环化。该方法能够提高文库插入片段长度，并且无需切胶回收；单链核酸分子热变性后可以直接进行环化。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂。

背景技术

自从上世纪九十年代AB公司推出毛细管电泳测序仪，人类基因组计划启动之后，DNA(Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸)测序技术便开始以难以想象的速度高速发展。第二、第三代测序仪也相继推出，面向市场。在第二代测序平台中，Complete Genomics公司(以下简称CG)的Blackbird测序平台凭借测序准确性相对其它平台更高(99.9998％)、测序通量相对其它平台更大的优势，在分子诊断等临床研究领域的应用中占据巨大的市场。然而，由于样品处理方法的限制，CG测序平台的文库插入片段太小(2×19～35bp)，导致后续的基因组组装工作困难，限制了该平台在基因组de novo测序方向的应用。另外，文库构建周期太长，也严重阻滞了科研、项目的开展进度，加上各种新一代测序技术迅速兴起所面临的挑战，通过技术改良和创新提高文库插入片段大小、简化建库流程、缩短建库时间，以拓展CG测序平台的应用范围和能效是迫在眉睫的重要研发任务。

CG平台现有的双接头单链环状文库构建流程的插入片段引入方法极大地限制了文库插入片段长度，SOLiD(Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)平台使用的NT(Nick Translation，切口平移)技术，文库插入片段长度有所提高，但是存在插入片段跨度很大的缺点，需要通过切胶回收的方法来进行片段选择，增加了操作的繁琐性，并且切胶回收会影响插入片段的回收效率。

此外，CG平台现有双接头单链环状文库构建方法的测序接头需要经过多步骤的酶反应及纯化才能连接到待测基因组DNA片段上，耗时、耗试剂且样品损耗大，限制了样品处理的速度，并且样品起始量(3μg)相对其它测序平台不具优势。

发明内容

本发明提供一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂，该方法能够提高文库插入片段长度，并且无需切胶回收；单链核酸分子热变性后可以直接进行环化。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法，包括如下步骤：

将核酸打断成用于文库构建的核酸片段；

在所述核酸片段的两端连接第一接头序列；

通过第一PCR扩增得到两端具有所述第一接头序列的第一产物，其中所述第一PCR使用的引物序列上具有U碱基位点；

用USER酶酶切所述第一产物，形成粘性末端后进行环化产生缺口；或所述第一PCR使用的引物序列上还具有切口酶识别序列，用USER酶酶切所述第一产物，形成粘性末端后进行环化，然后使用切口酶酶切环化产物产生切口；

以所述环状核酸分子为模板，从所述切口或缺口处开始进行限制性切口/缺口平移反应；

消化除去所述环状核酸分子上的未发生限制性切口/缺口平移反应的部分，得到线性核酸分子；

在所述线性核酸分子的两端连接第二接头序列；

通过第二PCR扩增得到两端具有所述第二接头序列的第二产物；