[发明专利]一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂

权利要求书

1.一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法，包括如下步骤：

将核酸打断成用于文库构建的核酸片段；

在所述核酸片段的两端连接第一接头序列；

通过第一PCR扩增得到两端具有所述第一接头序列的第一产物，其中所述第一PCR使用的引物序列上具有U碱基位点且具有或不具有切口酶识别序列，并且其中一条引物序列上具有第一亲和标记；

使用USER酶酶切所述第一产物，产生粘性末端且产生或不产生缺口；

对所述酶切后的第一产物进行环化，产生环状核酸分子；

使用去磷酸化酶处理双链上均具有缺口的环状核酸分子，或者使用切口酶处理一条链上具有切口酶识别序列且另一条链上具有缺口或双链均具有切口酶识别序列且均不具有缺口的环状核酸分子以产生切口；

使用带有第二亲和标记的固相载体与所述环状核酸分子结合；

以结合到所述固相载体上的环状核酸分子为模板，从所述切口和/或缺口处开始进行限制性缺口平移反应，所述限制性缺口平移反应是指通过控制dNTP与作为模板的核酸分子的摩尔比、酶反应温度和时间中至少一个因素来控制生成的缺口平移片段的长度的缺口平移反应；

消化除去所述环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分，得到线性核酸分子；

在所述线性核酸分子的两端连接第二接头序列；

通过第二PCR扩增得到两端具有所述第二接头序列的第二产物；

对所述第二产物进行变性得到单链核酸分子，并使用与其中一条单链核酸分子两端均互补的介导序列对所述单链核酸分子进行环化，得到双接头单链环状文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亲和标记为生物素标记；所述第二亲和标记为链霉亲和素标记。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一接头序列包括第一5’接头序列和第一3’L型接头序列，分别连接所述片段每条链的3’端和5’端；所述第一5’接头序列包括一条5’端磷酸化的长链和一条互补的短链，所述短链的3’末端双脱氧修饰，并且所述短链中包含U碱基位点；所述第一3’L型接头序列在邻近连接的片段的部分与所述第一5’接头序列有部分碱基互补；

在所述核酸片段的两端连接第一接头序列，具体包括：

对所述核酸片段进行去磷酸化；

对去磷酸化后的核酸片段进行末端修复；

在所述核酸片段的每条链的3’端连接所述第一5’接头序列；

使用USER酶酶切所述第一5’接头序列的短链的U碱基位点；

对USER酶酶切后的核酸片段进行磷酸化处理；

在所述磷酸化处理后的核酸片段每条链的5’端连接所述第一3’L型接头序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR使用的引物序列上均具有一个U碱基位点和切口酶识别序列；使用USER酶酶切U碱基位点后，在核酸片段两端形成粘性末端，所述粘性末端互补发生环化，产生环状核酸分子；再使用切口酶酶切所述切口酶识别序列产生切口。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一PCR使用的引物序列中有一条引物序列具有两个U碱基位点，另一条引物具有一个U碱基位点；使用USER酶酶切U碱基位点后，在核酸片段两端形成粘性末端，所述粘性末端互补发生环化，产生环状核酸分子。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述酶切后的第一产物进行环化之后，还包括：对未环化的核酸分子进行消化。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化除去所述环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分，具体包括：首先使用双链外切酶降解，直到两端的缺口相遇；然后使用单链外切酶降解单链；或使用核酸内切酶直接切掉所述环状核酸分子上的未发生限制性缺口平移反应的部分。