[发明专利]用于自诱导蛋白表达的方法和系统

说明书

本文中提供在不需要添加外源诱导物的情况下自诱导基因表达的方法和系统。在一个方面，提供一种双遗传元件系统，其包括第一高拷贝数遗传元件，所述第一高拷贝数遗传元件包含在诱导型启动子控制下的第一目的基因；和第二低拷贝数遗传元件，所述第二低拷贝数遗传元件包含编码转录因子的基因，所述编码转录因子的基因在表达后调节自所述诱导型启动子的转录；其中自所述诱导型启动子的转录的激活不需要添加外源诱导物。

技术领域

本公开内容总体上涉及用于体外基因表达的方法和系统，特别是遗传元件如带有调节元件的质粒。

背景技术

在抗体筛选过程如噬菌体展示期间，通常要筛选数百或甚至数千的命中以鉴定结合给定靶标的多个表位的各种抗体片段。对于这些命中中的每种都需要制备足够量的表达和纯化的抗体片段以用于进一步表征。典型地，编码相应抗体片段的基因被一同亚克隆到不同的表达载体中，或带有目的基因的噬菌体展示载体被转化成表达载体。然后，表达载体被转化到宿主细胞(典型地，大肠杆菌)中，并且转化体被接种到小量的培养物(1-3ml)中过夜培养。当培养物生长至对数期时，加入终浓度为0.1-1mM的诱导物(最常见的是用于lac启动子的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))以诱导抗体片段的表达。

当同时处理数百或甚至数千种细胞培养物时，非常困难的是保证在诱导前所有的培养物都处于基本相似的生长状态。时滞或生长速率的差异通常导致这样的情形，其中不同的培养物处于不同的生长期中并且适于诱导的时间不同。通常需要相当的努力以通过在不同时间点测量600nm处的光密度(OD)(OD600)来跟踪不同培养物的生长，然后单独地在合适的时间向各培养物中添加IPTG。

因此，在将克隆接种到液体培养物中后不需要监视多个培养物的生长期且不需要添加诱导物的自诱导表达系统具有优势。第一个自诱导系统由F.William Studier(Studier(2005)Protein Expr Purif 41(1):207-234)开发。该系统是基于流行的pET细菌表达系统，其中靶蛋白由被T7RNA聚合酶非常特异地识别的强效T7启动子控制。T7RNA聚合酶又被置于已被很好表征的诱导型lac启动子的控制下。普遍接受的是，常用于细菌蛋白表达的野生型lac启动子太弱而无法直接表达靶蛋白(Rosano等(2014)Frontiers inMicrobiology 5(172)1-17；Deuschle等(1986)EMBO J 5(11):2987-2994；Makoff等(1991)Nucleic Acids Res 19(9):2417-2421)，并且因此其更常与其他诱导型系统如T7表达系统一起使用。然而，本领域中已知，T7启动子介导的蛋白表达在细菌细胞内可能过强。因此，T7启动子通常不优选用于在大肠杆菌中表达膜蛋白或分泌蛋白((Wagner等(2008)Proc NatlAcad Sci USA 105(38):14371-14376)，因为在胞质中过快地产生过多的蛋白，并且其压倒细菌分泌系统的有限能力，这导致蛋白的积累和聚集、对宿主细胞的毒性并且最终导致宿主细胞死亡。

一种针对膜蛋白生产设计的改进的pET系统采用受调节的T7溶菌酶(一种T7RNA聚合酶的抑制剂)的表达以下调T7RNA聚合酶的活性从而减缓蛋白生产速率(Wagner等(2008)Proc Natl Acad Sci USA 105(38):14371-14376)。然而，该系统需要小心地滴定诱导物L-鼠李糖的浓度。此外，以上现有的自诱导系统与噬菌体展示系统不相容并且需要将目的基因由展示载体亚克隆到新的表达载体，这是耗时耗钱的。

Genentech也开发了一种细菌表达系统，其是基于PhoA启动子(Simmons等,Journal of Immunological Methods 263(2002)133–147)。当培养基中的磷酸盐浓度被耗尽时，靶蛋白被诱导。然而，该系统要求大肠杆菌转化体在专门的C.R.A.P.磷酸盐限制性培养基中生长，这种培养基的制备费用相当昂贵。