[发明专利]一种基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法

权利要求书

1.一种基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法，其特征在于：以甘油酯作为原料，通过脂肪酶水解和P450脱羧的偶联催化，即脂肪酶水解甘油酯生成游离脂肪酸，生成的脂肪酸再经过P450脱羧产生脂肪烯烃。

2.按权利要求1所述的基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法，其特征在于：以外源添加的油脂为底物，以外源供给的过氧化氢为辅因子，在催化剂的作用下于20-50 ℃条件下反应0.5-48h，偶联催化制备脂肪烯烃；

所述催化剂选自重组表达的脂肪酶和P450脂肪酸脱羧酶的生长态细胞培养液；重组表达的脂肪酶和P450脂肪酸脱羧酶的静息态全细胞；重组表达的脂肪酶和P450脂肪酸脱羧酶的无细胞粗提液；重组表达的脂肪酶和P450脂肪酸脱羧酶的纯酶中的一种。

3.按权利要求2所述的基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法，其特征在于：以0.2-100mM油脂作为底物，0.2-300mM、体积浓度为0.3%的过氧化氢溶液作为辅因子，在催化剂的作用下偶联催化反应在pH为4-12的缓冲液体系下反应，反应后加入与反应物等体积含有内标的乙酸乙酯或正己烷萃取分析，油脂转化为脂肪烯烃的转化率为10-85%；

所述催化剂中脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶摩尔比为1：100-100：1。

4.按权利要求1-3任一项所述的基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法，其特征在于：所述油酯为动植物来源的油脂、微生物来源的油脂或含高酸价的废弃油脂；

所述脂肪酶为对油酯具有水解作用的脂肪酶。

5.按权利要求4所述的基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法，其特征在于：所述油酯为大豆油、菜籽油、玉米油、棉籽油、微藻油、酵母源油脂、鱼油，或地沟油；

所述脂肪酶为疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）脂肪酶Tll、黑曲霉（Aspergillus niger）脂肪酶、白地霉（Geotrichum candidum）脂肪酶、皱褶假丝酵母（Candida rugosa）脂肪酶、南极假丝酵母（Candida antarctica）脂肪酶、米曲霉（Aspergillus oryzae）脂肪酶、米根霉（Rhizopus oryzae）脂肪酶、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolylica）脂肪酶、米赫毛霉（Mucor miehe）脂肪酶、粘质沙雷氏菌（Serratiamarcescens）脂肪酶、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）脂肪酶或芽孢杆菌属（Bacillus sp.）脂肪酶；

所述P450脂肪酸脱羧酶为源于Jeotgalicoccus sp.的OleT_JE或来源于Bacillussubtilis的P450_BSβ。

6.按权利要求1-3任一项所述的基于脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶偶联催化的脂肪烯烃催化合成的方法，其特征在于：所述催化剂按如下方式获得：

1）通过分别构建含有目的脂肪酶基因与P450脂肪酸脱羧酶基因的重组质粒，分别将获得的重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，分别获得表达脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶的重组大肠杆菌基因工程菌株；获得的大肠杆菌基因工程菌株作为出发菌株通过两阶段发酵；

2）发酵液即为生长态细胞培养液作为催化剂；

发酵液通过离心分离收集过表达脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶的重组大肠杆菌细胞，即为静息态全细胞作为催化剂；

发酵液经超声破碎细胞，获得脂肪酶与P450脂肪酸脱羧酶的无细胞粗提液作为催化剂；

或，发酵液利用重组酶His-tag与Ni-NTA的亲和层析所得纯酶作为催化剂。