[发明专利]一种L‑苯丙氨酸糖酸转化率提高的谷氨酸棒杆菌重组菌

权利要求书

1.一种谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，缺失了L-Phe吸收途径的基因aroP、乙酸脱氢酶系I基因aceE、乳酸脱氢酶基因ldh、葡萄糖转运PTS系统的基因pstI，在原pstI位点整合了非依赖于PEP消耗的葡萄糖转运基因iolT2-ppgK，同时转入了含有L-Phe合成途径八个关键酶的调控表达质粒；所述基因pstI、iolT2-ppgK、aroP、aceE、ldh的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示；所述的八个关键酶为编码3-脱氧-D阿拉伯庚酮糖-7磷酸合酶的aroF^fbr、编码莽草酸脱氢酶的aroE，编码磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的ppsA、编码转酮酶的tktA、编码分支酸变位酶/预苯酸脱水酶双功能酶的pheA^fbr、编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的aroA、编码氨基转移酶的tyrB和编码莽草酸激酶的aroL；所述八个关键酶的核苷酸序列分别是：SEQ ID NO.17、Gene ID:3343183、Gene ID:14791674、Gene ID:3343601、SEQ ID NO.18、Gene ID:3345010、Gene ID:12933673、Gene ID:12930837所示的序列。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述出发菌株为C.glutamicum ATCC 13032。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述表达质粒，包括一个过表达aroF^fbr、aroE、ppsA、tktA基因的质粒，和一个过表达pheA^fbr、aroA、tyrB、aroL基因的质粒；所述表达质粒的构建方法，是aroF^fbr与aroE融合，ppsA与tktA融合，连接表达载体pEC-XK99E后，在aroF^fbr-aroE、ppsA-tktA前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pEC-XK99E-Ptac-aroF^fbr-aroE-Plac-ppsA-tktA即pSUTL，pheA^fbr与aroA融合，tyrB与aroL融合，连接表达载体pXMJ19后，在pheA^fbr-aroA、tyrB-aroL前分别插入启动子Ptac和Plac构建重组质粒pXMJ19-Ptac-pheA^fbr-aroA-Plac-tyrB-aroL即pSDTL；所述启动子Ptac序列是SEQ ID NO.15所示的序列；所述Plac的序列是SEQ ID NO.16所示的序列。

4.一种权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌的构建方法，步骤如下：

(1)根据目标基因及其上下游序列，构建目标基因缺失的敲除框后与载体pk18mobSacB连接，构建成1个pstI基因缺失处整合了iolT2-ppgk基因的敲入载体pK18mobSacB-ptsI-iolT2-ppgk-ptsI和3个分别缺失aroP、aceE、ldh基因的敲除载体pK18mobSacB-aroP、pK18mobSacB-aceE、pK18mobSacB-ldh；

(2)将4个载体转化到C.glutamicum获得阳性转化子，即C.glutamicumΔptsI::iolT2-ppgKΔaroPΔaceEΔldh；

(3)将过表达L-Phe合成途径八个关键酶aroF^fbr、aroE、ppsA、tktA、pheA^fbr、aroA、tyrB、aroL的质粒转化到步骤2得到的菌株中，即获得谷氨酸棒杆菌重组菌株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体pk18mobSacB被载体pk19mobSacB替代。

6.一种利用权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌重组菌提高L-Phe糖酸转化率的方法，其特征在于，所述方法是将重组菌的种子活化后，接种到发酵培养基中，加入IPTG诱导质粒表达重组酶，通风发酵培养60-80h；所述发酵培养基按g/L计含有：葡萄糖100.0，玉米浆固体干粉6.0，硫酸铵25.0，硫酸镁0.5，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸钠2.0，碳酸钙20.0，pH 6.8-7.0。

7.权利要求1所述重组菌在L-Phe生产以及食品、医药领域的应用。