[发明专利]一种螺旋藻基因转化筛选的方法

权利要求书

1.一种螺旋藻基因转化筛选的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)构建获得包含有两个插入序列、gfp基因、nptII标记基因和Ap标记基因的螺旋藻整合筛选质粒pEGFP-IS-IS-Km；

2)供体质粒pEGFP-IS-IS-Km的超声转化和筛选：用EcoRⅠ酶切pEGFP-IS-IS-Km，获得线状质粒，两端各有一个IS序列，与转座子特征结构类似，用实验室超声转化法转化螺旋藻869s，以苄青霉素和G418(nptII)筛选出插入突变的螺旋藻株，两步筛选法筛选突变株，抗性平板初筛，梯度稀释后利用荧光显微镜挑出单根绿色荧光藻，然后超声波复筛，进行扩大培养，筛选出优良性状藻株。

2.如权利要求1所述一种螺旋藻基因转化筛选的方法，其特征在于在步骤2)中，所述初筛的方法如下：通过超声转化法将构建好的螺旋藻整合筛选质粒pEGFP-IS-IS-Km转化螺旋藻，以含有200μg/mL Amp和60μg/ml G418的Zarrouk固体培养基筛选转化藻株；10～15天后，转化组在含有G418和Amp的抗性平板上长出绿色藻落，即为转化藻株。

3.如权利要求1所述一种螺旋藻基因转化筛选的方法，其特征在于在步骤2)中，所述复筛的方法如下：从初筛的抗性平板上分别挑取若干单藻落，接到含有100μg/mL Amp和30μg/mL G418的Zarrouk液体培养基中继续培养10～20天，吸取少许藻液于载玻片上，在荧光正置显微镜下观察，用自制的微吸管分离吸取发绿色荧光的转化藻株至5ml EP管中，继续培养15天后，用超声波将其处理成3～5个细胞的短藻丝体后，再加入100μg/mL Amp和30μg/mL G418，继续培养20～30天；再次进行上述步骤，如此反复直至所有藻丝体在荧光显微镜下均发绿色荧光为止。