[发明专利]高纯度河豚毒素的提取方法

说明书

技术领域

本发明是一种海洋生物活性物质的分离提取方法，属于天然生物产品提取技术领域。

背景技术

河豚毒素是存在于河豚鱼体内的一种有毒物质，去水河豚毒素是河豚毒素的衍生物，两者的区别仅在后者比前者少一个水分子，但其毒力后者仅为前者的1%。一般情况Anh-TTX与TTX存在于同一生物体中，主要存在于河豚鱼的卵巢、肝脏、皮肤和肠胃中，在虾虎鱼、螺类、章鱼、蟹类、和海星等，海生陆产的两栖类、软体动物、节肢动物等都已检测到TTX和Anh-TTX，并发现TTX和Anh-TTX可能来源于一些细菌如弧菌、假单胞菌等。

     TTX是生物细胞Na+通道的阻断剂，其生理作用是快速可逆阻断Na+通道，所以，可广泛用于神经生物学和生理学及其他科学研究。

    Anh-TTX分布于多种生物中，在生物体内含量极少，约为百万分之一至千万分之一。由于Anh-TTX与TTX分子结构、分子量及理化性质非常接近，提取TTX时总是含混有Anh-TTX，要在TTX中分离Anh-TTX非常困难，目前尚未见有分离Anh-TTX的报道。

 为了提高提取河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）的纯度，分离去水河豚毒素（Anhydroterodotoxin，Anh-TTX），去水河豚毒素是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，其分子式和结构如下：

分子式：C₁₁H₁₅O₇N₃，分子量301.27.

结构式：

发明内容

为了克服上市现有技术中的不足，本发明公开了一张在提取TTX过程中，建立一种分离Anh-TTX的有效方法，使制备出的TTX中不含有Anh-TTX，从而得到高纯度河豚毒素。

 本发明的目的是这样实现的：

    一种分离去水河豚毒素精制河豚毒素的方法，按下列步骤提取：

（1）    醇醚扩散法纯化TTX：先将粗品河豚毒素加4-22%醋酸溶解，加无水乙醇1-12倍，离心除去不溶物，然后将上清液移到小烧杯，贮藏在密闭的容器中，并另放一杯乙醚，控制温度3-35℃、10-48小时，最后将醇醚溶液经离心分离出沉淀物；

（2）    高压液相色谱进一步分离去水河豚毒素：将上述沉淀物，用1-32%磷酸溶解，用流动相组成含有0.1-12%甲醇的0.01-0.25M磷酸盐缓冲液，调PH为5.7，流动相流速1-20ml/min，用示差检测器进行检测，分离过程按记录仪上出峰图，分离去水河豚毒素馏份;

（3）    河豚毒素的脱盐、回收：选择填料为酸性阳离子交换树脂和生物凝胶，洗脱剂用1-22%的醋酸，收集PH4-7馏份，加氨水调节PH7.5-10，可沉淀出河豚毒素，经反复分离提取和脱盐，可得到纯品河豚毒素结晶。

不含去水河豚毒素的高纯度河豚毒素的具体提取方法为：

一.醇醚扩散法纯化TTX

取粗品TTX10-2000mg，溶入0.5-40ml  4-22%HAC中，在此溶液中边搅拌，边加入1-80ml无水乙醇，离心除去不溶物，把溶液移到小烧杯中，贮藏在密闭的容器中，并放上一瓶乙醚溶液。当乙醚向TTX-HAC-CTOH-H₂O溶液扩散时，导致TTX结晶出来，经离心即可得到沉淀物，Anh-TTX留在废液中。

二.去水河豚毒素（Anhydroterodotoxin，Anh-TTX）的HPLC分离。

以上得到的沉淀物利用HPLC分离Anh-TTX.

 ①制备柱150-400x10-40mm

②固定相：反相硅胶C₁₈

③洗脱液为含0.1-12%甲醇的磷酸盐缓冲剂，PH5.7

④示差检测器检测

⑤泵压力100-2500PSI

⑥分离过程按记录仪上Anh-TTX峰图馏份。

三.TTX的脱盐、回收

①交换柱200-600x10-400mm

②固定相位酸性阳离子交换树脂和P₂生物胶。

③洗脱剂为1-22%HAC

④洗脱馏份按每份0.5-5ml收集

⑤以PH试纸对集馏份进行PH测定

⑥对PH4-7馏份加NH₄OH调节PH7.5-10，可得到沉淀物。

⑦沉淀物水洗、真空干燥。