[发明专利]一种耐高温α‑淀粉酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及基因的定点突变和重组技术，尤其是一种新型的耐高温α-淀粉酶及其制备方法和应用。

背景技术

目前国内外生产耐高温α-淀粉酶所用菌株大多数是嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheninformis)，与其它细菌所产α-淀粉酶相比具有更好的耐热性，而且地衣芽孢杆菌具有较高的生长温度、良好的产物合成效率、优秀的蛋白质合成与分泌能力，因此被广泛的应用于工业生产。

B.licheninformis所产的耐高温α-淀粉酶(BLA)由于良好的耐热性广泛地应用于淀粉水解工艺中，但随着国内外淀粉原料深加工工业的高速发展，造成耐高温α-淀粉酶的应用领域不断扩大，例如应用于淀粉加工、纺织物退浆、食品加工、啤酒和酒精生产、医药行业、发酵行业以及石油开采工业等方面。其中开发稳定性高的α-淀粉酶成为目前α-淀粉酶酶制剂研究领域的一个重要方向。

现阶段应用于淀粉液化过程中的耐高温α-淀粉酶的最适温度和pH一般在95℃和6.5左右，为了保持活力一般需要加入一定浓度的Ca²⁺，为了保证耐高温α-淀粉酶在淀粉液化过程中发挥较高的活力，需将天然粉浆的原始pH由(3.2-4.5)调至(5.8-6.2)，在下一步糖化过程中又要将糖化液的pH调至4.2-4.5，这两步pH调整过程中既增加了工艺的繁琐度也降低了经济效益，所以在理想的工艺步骤中需要开发研制一种在高温和酸性环境下活力稳定的耐高温α-淀粉酶。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过定向进化构建的在高温和酸性环境下酶活力更稳定的高温α-淀粉酶突变体及其制备方法。

本发明实现目的技术方案如下：

一种新型的耐高温α-淀粉酶突变体，是通过对野生型耐高温α-淀粉酶进行定向进化，通过重叠PCR和定点突变，获得氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示的耐高温α-淀粉酶突变体，经宿主细胞枯草芽孢杆菌高效表达后获得新型的耐高温α-淀粉酶。

所述耐高温α-淀粉酶突变体为：碱基C946→A、A947→G、T948→G，氨基酸His316→Arg。(上述表示方法为：原始氨基酸/碱基位置→替换的氨基酸/碱基。)

所述耐高温α-淀粉酶突变体的基因序列如SEQ ID NO：6所示。

所述野生型耐高温α-淀粉酶的基因序列如SEQ ID NO：5所示。

所述野生型耐高温α-淀粉酶来源是地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。

优选的，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600，该菌为6种胞外蛋白酶缺失菌。

所述耐高温α-淀粉酶突变体用于淀粉的水解，酶活力为3270U/mL。所述耐高温α-淀粉酶突变体在90℃、pH6.0的半衰期比野生型提高了93.5％；在pH 4.5、70℃的半衰期比野生型提高了41.2％。

所述新型的耐高温α-淀粉酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)定点突变野生型耐高温α-淀粉酶的成熟肽基因，第946位碱基C→A，第947位碱基A→G，第948位碱基T→G，得到新型的耐高温α-淀粉酶基因；

(2)将上述新型的耐高温α-淀粉酶基因，与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBAPR载体相连，pBAPR带有一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶强启动子P_APR、一个果聚糖蔗糖酶基因信号肽序列sacB，得到携带新型的耐高温α-淀粉酶基因的重组表达质粒；

(3)将重组质粒转化入宿主菌株枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600中，得到重组菌株；

(4)将重组菌株进行发酵，分泌表达制备新型的耐高温α-淀粉酶；

(5)分离提取新型的耐高温α-淀粉酶。

本发明的优点和积极效果如下：