[发明专利]脲酶米氏常数测定方法

权利要求书

1.一种脲酶米氏常数测试方法，其特征在于：以一系列不同浓度的尿素为底物，酚红为指示剂，脲酶分解尿素产氨，pH值上升，在酚红指示剂的作用下，体系的颜色变深，吸光度的增加，吸光度的增加与酶促反应速度成正比，以吸光度的增加代表反应速度，用吸光度增加值的倒数1/△A代替双倒数方程中的1/V，对底物尿素浓度的倒数1/[S]作图，根据双倒数方程1/V=Km/（Vmax[S]）+1/Vmax可得直线在X轴上的截距即为-1/Km，求得Km值。

2.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于：配制的脲酶溶液活力单位为10kU/L左右。

3.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于：使用系列浓度梯度的尿素缓冲溶液为底物，尿素浓度为4-20mmol/L ，一般浓度设置为4、5、6.67、10、15和20mmol/L。

4.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于：各种不同浓度的尿素溶液均以pH值6.8的磷酸缓冲液的配制。

5.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于：缓冲液以酚红卫指示剂，含酚红0. 002%。

6.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于：反应体系里加一定量的脲酶溶液和上述权利要求3-5所述的尿素缓冲液。

7.以96孔板为例，每孔分别加25μL巨豆脲酶(10kU/L)， 200μL尿素缓冲溶液（尿素浓度分别为4、5、6.67、10、15、20mmol/L的），每种浓度的尿素至少三个重复。

8.一种权利要求1所述的脲酶米氏常数测试方法，其特征在于：连续多次测定体系的吸光度，对于每个时间点的吸光度，均按照双倒数方程1/V =Km/（Vmax[S]）+1/Vmax，以吸光度的增加△A代表反应速度，用吸光度增加值的倒数1/△A代替双倒数方程中的1/V，对底物尿素浓度的倒数1/[S]作散点图，得到一系列双倒数曲线及对应的线性方程，选取相关系数大于98%的曲线及其方程，求得其在X轴上的截距即-1/Km，进一步计算得到Km值。