[发明专利]MDCK克隆细胞株及其应用

说明书

本发明公开了MDCK克隆细胞株及其应用，属于MDCK克隆细胞株领域。本发明采用有限稀释法进行MDCK单细胞克隆，进一步亚克隆，最终获得2株性能优异的单克隆细胞株；这两株单克隆细胞株的生长速度较母本细胞快，能够很好繁殖禽流感病毒，显著提高病毒在细胞中的复制水平，获得较高效价的病毒液，相比母本细胞培养的病毒HA效价滴度有显著提升。两株细胞株的微生物保藏编号分别为：CGMCC No.10008和CGMCC No.10009。本发明提供的MDCK克隆细胞株能够高效培养病毒，显著提高病毒滴度，在流感病毒的疫苗生产中应用价值高。

技术领域

本发明涉及克隆细胞株，尤其涉及MDCK克隆细胞株，本发明还涉及所述MDCK克隆细胞株在培养禽流感病毒中的应用，属于MDCK克隆细胞株的克隆和应用领域。

背景技术

过去中国一直通过鸡胚生产禽流感疫苗，需要消耗大量鸡胚，生产周期长，易污染，不易于控制。这种生产方法效率低，不利于应对大规模的流感爆发。禽流感在中国不同地区流行情况不同，并且禽流感在不同地区之间的扩散快；用鸡胚生产禽流感疫苗，必须提前做出精确计划，但一般来说禽流感多呈爆发流行，难以在短时间内购置生产疫苗所需的数百万只鸡蛋。为此，世界卫生组织鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养技术来生产流感疫苗。

以哺乳动物细胞为基质制备疫苗无外源因子污染、易于规模化生产、能较好的维持病毒抗原稳定等优点。Tina Lombardo等人通过多种细胞培养禽流感病毒，通过比较发现，狗肾来源的MDCK细胞系是禽流感病毒最易感的细胞，具有下列优势：(1)容易扩大；(2)容易收集细胞。

但是，目前MDCK细胞培养流感病毒的病毒滴度与用鸡胚培养方法相比，仍然较低，制约了其在制备禽流感疫苗中的应用。亟需要从MDCK母本细胞株中筛选获取能够有效提升禽流感病毒滴度的MDCK克隆细胞株。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是从MDCK母本细胞株中克隆得到能够有效增殖禽流感病毒且显著提高病毒滴度的MDCK克隆细胞株。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明选择种细胞MDCK，采用有限稀释法进行MDCK单细胞克隆，然后选取单个克隆进一步亚克隆，经3次亚克隆，最终获得5株单克隆细胞，分别命名为MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2。

本发明对5株单克隆细胞MDCK-1F7、MDCK-1E3、MDCK-2F6、MDCK-2D6和MDCK-3E2的形态、胰酶敏感性和生长特性进行了研究并对禽流感病毒的适应性进行了分析。实验结果显示，MDCK-1F7和MDCK-2D6两株克隆细胞的性能最优异。与母本细胞相比，单克隆细胞株MDCK-1F7和MDCK-2D6生长速度显著加快；对0.25％胰酶敏感，同母本细胞相比消化效率成倍提高；应用MDCK-1F7和MDCK-2D6接种禽流感病毒H5N1RE-6株，能够很好繁殖重组禽流感病毒H5N1RE-6株，显著提高了该病毒在细胞中的复制水平，并且获得较高效价的禽流感病毒液，其血凝效价HA不低于2⁸，与母本MDCK细胞培养的病毒的HA效价2⁷相比，提高了一个滴度。

本发明将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-1F7提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10008；分类命名是：MDCK克隆细胞株；保藏时间是：2014年11月25日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明将获得的MDCK克隆细胞株MDCK-2D6提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.10009；分类命名是：MDCK克隆细胞株；保藏时间是：2014年11月25日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。