[发明专利]用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法

权利要求书

1.一种用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：根据鱼类群落所在水域的大小，采集水样；

步骤(2)：将所述的水样进行处理后，提取其中的总环境DNA；

步骤(3)：将所述的总环境DNA采用核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的16srDNA序列作为通用引物进行PCR扩增，得到PCR产物；

步骤(4)：将所述的PCR产物进行凝胶电泳，得到带有DNA的凝胶；

步骤(5)：将所述的带有DNA的凝胶进行切胶克隆测序后通过GENBANK进行blast比对，以确定所述的DNA是否为鱼类序列；

步骤(6)：确定所述的DNA为鱼类序列后，采用二代测序技术对所述的PCR产物的组成情况进行大规模分析，以确定环境中DNA的鱼群的组成和鱼类的群落结构。

2.根据权利要求1所述的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(1)的采集水样为从需要调查的样点区域采集柱状水层的水样后等体积混合。

3.根据权利要求1所述的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的处理为对所述的水样采用3μm滤膜进行抽滤，抽滤后将所述的滤膜放入无菌水中高速震荡10min，在5000转速下离心，收集沉淀后于-20℃保存。

4.根据权利要求1所述的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的处理为对所述的水样采用离心机在10000转速离心，去上清液，加入10ml缓冲液，超速离心分离。

5.根据权利要求1所述的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的处理为使用3μm滤膜抽滤，并收集所述的滤膜。

6.根据权利要求1所述的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(2)中的提取为采用试剂盒提取所述的总环境DNA并溶于TE缓冲液中于-20℃保存或采用酚氯方法提取所述的总环境DNA。

7.根据权利要求1所述的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(3)中PCR扩增的反应条件为：4℃预变性2min，94℃变性30s，52℃退火40s，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min；

PCR扩增的反应体系为每25ul体系中：2.5ul 10×PCR buffer，2.5mM浓度的dNTP2ul，浓度为10uM的正反引物各1ul，5U/ul的Taq酶0.15ul，DNA模板10ng，采用灭菌水补足。

8.根据权利要求1所述的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，所述的凝胶电泳为取所述的PCR产物于1％的琼脂糖凝胶中，电压100V，电泳45min，用溴化乙锭染色8min，最后在凝胶成像系统上拍照，并统计引物的扩增效果。

9.根据权利要求1所述的用于鱼类群落结构研究的环境DNA鉴定方法，其特征在于，所述的步骤(6)中采用罗氏454测序平台对PCR产物的组成情况进行大规模分析。