[发明专利]一种伪狂犬表位多肽基因工程疫苗

说明书

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种伪狂犬(Pseudorabies virus，PrV)表位多肽基因工程疫苗的制备与应用。具体地，利用基因重组技术，将PRV主要糖蛋白gB、gC、gD的B细胞中和表位和T细胞免疫表位与牛疱疹病毒1型(Bovine Herpesvirus 1，BHV-1)被膜蛋白VP22串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到伪狂犬表位多肽基因工程疫苗以及该疫苗在预防重大动物疾病伪狂犬病中的应用。

背景技术

伪狂犬病是一种发生于家畜、野生哺乳动物、伴侣动物和实验动物中，以发热、奇痒(猪除外)以及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)引起的。伪狂犬病病毒的基因组DNA为线状双链，长约150kb，由独特长区段(UL)、独特短区段(US)、短区段两侧的末端重复序列(TR)和内部重复序列(IR)组成。伪狂犬病毒的基因组DNA至少可编码70个基因，其中许多基因是非必需的可通过缺失毒力基因而致弱，而且其庞大的基因组，可以容纳较大外源基因的插入。

在UL区已被定位的基因共58种，包括已被测序的编码糖蛋白gB(gII)、gC(gIII)、gH、gK、gL、gM、gN、TK、碱性核酸酶(AN)、核糖核苷还原酶(RR)、DNA多聚酶(POL)、DBP(136kDa DNA结合蛋白质)、MCP(主要衣壳蛋白)、ICP18.5蛋白和早期蛋白O(EPO)等基因。US区已被全部测序，其中包括编码蛋白激酶(PK)、糖蛋白gG(gX)、gp50(gD)、gp63(gI)和gI(gE)的基因及编码11kDa和28kDa的基因。IR区的早期基因(IE)和RSp40基因也得到了鉴定和测序，且证明不同毒株间的IE基因存在差异。另外IR与UL连接区的潜伏基因也已得到鉴定。现已知的9种PrV包膜糖蛋白(gX、gp50、gp63、gI、gII、gIII、gH、gM和gL)中除gX外，其它均为成熟病毒子的结构成分，只有gX是非结构成分，常存在于感染细胞中，病毒子上没有发现。到目前为止，已证实gI、gIII、gp63、gX和gM对病毒体内增殖是非必需的，而gII、gp50、gH和gL为病毒复制所必需。

目前广泛应用的gE单基因缺失疫苗在使用过程中己逐渐爆露其局限性，具体表现在：gE缺失疫苗免疫后，尽管能减少野毒感染后产生临床症状以及感染后野毒的排出，但是在具有高母源抗体的猪如育成猪或育肥猪，使用gE疫苗后不能有效地激发中和抗体，因而在感染后排出病毒较多(Gielkens L J，1984；Molitor T W etal.，1992)， 故母猪需要重复接种，并建议商品猪在8、12、16周分别免疫一次。同时gE的缺失导致病毒在体内增殖很快，尤其是在巨噬细胞、骨髓细胞和淋巴细胞中，虽然gE基因缺失株毒力有所下降，但对免疫系统的特别的亲嗜性可能会产生免疫抑制。gG缺失疫苗与其它疫苗的比较方面，也有不同的结论：无论母源抗体存在与否，gX和gE缺失疫苗在诱导中和抗体滴度和阻止感染后排毒方面均无差异(Boeker M，etal.，1999；Pensaert M B，De Waele K，1990)，Vamier P etal(1991)。将gG与gE缺失苗分别溶于水中，gG(gX)免疫后诱导的抗体水平略高于gE缺失苗。RzihaHJetal(1989)比较了TK/gE和gE/TK两种缺失突变株在体内的增殖。结果说明：gE/TK在感染后6周，用免疫抑制剂处理猪后，可从许多组织中检出该缺失株的DNA，而TK/gE只在神经组织和扁桃体中增殖，而且以极低的数量增殖，用免疫抑制剂处理猪后，不能检测到感染性的病毒粒子，这一结果支持早期研究结果(Kit etal.，1985)，即TK基因阴性的疫苗可降低病毒形成潜伏感染的能力。

尽管针对PrV病毒产生的保护性免疫作了大量的研究，但对于保护力产生的机理和抗原的确切性质仍有许多未知的因素，大多数研究都强调了细胞免疫的重要性。但Prv病毒免疫应答的机制较为复杂，被动免疫只能阻断病毒从最初增殖的上皮细胞中扩散，但不能阻止病毒在接种部位的复制和增殖。从表达高水平主要组织相容性复合体(MHC)I类抗原的上皮细胞消除感染，必须借助细胞毒性T淋巴细胞，而在不表达MHC的神经细胞中消除感染则依赖于抗体。抗体在保护力中发挥一定作用，但是抗体滴度与临床保护力之间的相关性是不完全的，因为有些抗体阴性猪在攻毒时部分获保护(Andries etal，1978；McCawand Xu，1993)。