[发明专利]一段特异性调控逆境条件下植物蛋白稳定性的多肽序列及其应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术将一段多肽与目的蛋白融合从而调控目的蛋白在转基因植株中的表达水平，使其仅在各种逆境胁迫条件下特异性积累、但在植株正常旺盛生长时被降解，从而保证转基因植物既能正常生长发育又能具有较强逆境抗性，以及该肽段在科学研究与基因工程技术领域的应用。

背景技术

我国是一个以农业为基础的国家，但是随着人口的逐年增长、耕地面积的不断减少和农业可利用资源的日趋紧张，粮食供给面临着巨大挑战。提高和稳定粮食产量已成为我国当前国家重大战略发展的需求（周建军等，2014）。同时，随着生活水平的提高，人们对品味、口感、营养价值和欣赏价值等品质性状也越来越关注，迫使植物育种工作者在提高作物产量的同时培育富含营养（特别是一些特定蛋白质和氨基酸）、品质优良的作物新品种。为了解决这些问题，大量生物技术被逐渐应用于农业生产并且发挥越来越重要的作用，如植物基因工程、组织培养、细胞工程等技术。

植物基因工程技术是利用重组DNA技术，有计划地在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对生物基因进行改造和重新组合，然后再插入、整合到事先准备好的受体植物基因组中，使重组基因在受体细胞中表达，从而使受体植物获得新的性状，培育出高产、多抗和优质的新品种（候文邦等，2005）。利用植物基因工程技术可以更方便地对更多基因进行有目的的操作，打破自然界物种间难以交配的天然屏障，将不同物种的基因按人们的意志重新组合，拓宽了植物可利用的基因库，为创造新种质资源、培育植物新品种开辟了新的技术路线。自1983年首次获得转基因烟草、马铃薯以来，植物基因工程的研究和开发进展十分迅速。截止1997年，全球大约进行了25000次转基因作物的田间试验，涉及10个国家、60种作物、10个性状（成宝珍等，2014）。目前，已育成了一大批耐除草剂、抗病、抗虫、抗逆的高产、优质农作物新品种，并开始在农业生产上大面积推广应用（候文邦等，2005）。

近年来发现的大量具有应用价值的潜力基因，例如拟南芥中关键的逆境诱导转录因子DREB1A（Kasuga等，1999）和CBFs（Hsieh等，2002a；Hsieh等，2002b）等，它们在转基因植物中组成型过表达后可以获得预期的优良表型，如增强转基因植株对特定胁迫的抗逆性、延缓植株的衰老等，但是往往伴随着影响植株在合适生长条件下的正常生长和发育，导致植株矮小、生长迟缓或产量下降等。如果可以特异性地表达这些基因，让它们在特定的发育阶段或胁迫条件下高表达，而在正常的生长过程中维持在较低的基础水平，可以大大提高它们在基因工程中的应用性。对此，人们通常习惯使用组织特异性启动子驱动目的基因的表达来实现这一目标（Kasuga等，1999；Lee等，2003；Kasuga等，2004；Kovalchuk等，2013；Li等，2013；Wang等，2013）。但是，这一方法也有其局限性。首先，目前为止分离获得和应用的组织特异性启动子还比较少，并且伴随着活性低、组织特异性不高的缺点。启动子活性过低会限制目的基因的表达，导致其无法达到发挥功能所需要的水平；其次，一般来说，具有育种潜力的基因在整合到受体植物基因组中以后，需要转录翻译为相应的蛋白质来发挥调控植物生长发育的功能，而基因表达调控需要转录和转录后两个层次的控制。转录后/翻译后水平的调控对多数基因的功能发挥起重要作用，有时仅仅利用特异性启动子很难达到满意的效果。而通过在蛋白水平上调控目的基因的表达能够很好地弥补这些缺陷，具有很大的应用潜力。

最近，Jang等人发现拟南芥RAD23a蛋白的泛素相关结构域1（UBA1）和UBA2作为稳定信号可以显著地增强两种短命的转录因子HFR1和PIF3的稳定性，从而使转基因植株表达现出比单纯过表达这两个转录因子的植株更强的表型。拟南芥DDI1蛋白的UBA结构域也可以延长茉莉酸信号路径上的短命蛋白JAZ10.1的半衰期。他们指出可以根据UBA结构域的特性将它与植物中其他短命蛋白融合，增强其稳定性，用于对这些蛋白功能的基础性研究以及作物的改良（Jang等，2012）。由此可见，获得可以在蛋白水平特异调控基因表达的多肽，将其与目的蛋白融合，从而促使其在特定的发育阶段或特定的环境胁迫条件下积累，而在其他情况下维持低水平，不仅有助于阐明某些植物蛋白的生物学功能等基础理论问题，更可以有目的地控制转基因植物中育种潜力基因的表达，从而调节转基因植物的发育、提高农作物的产量和改善其品质。目前已分离鉴定的这类特殊多肽（或肽段）及其应用技术还相对较少，但是这一方法势必将成为农作物性状改良与新品种培育的新的强有力工具，具有广泛的应用价值。