[发明专利]荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用。

背景技术

荧光假单胞菌是一种革兰氏阴性细菌，广泛分布于各种环境。荧光假单胞菌是重要的水生动物病原菌，能够感染水生脊椎动物和无脊椎动物，前者包括多种养殖经济鱼类。对鱼类而言，荧光假单胞菌感染宿主范围广，既包括淡水鱼类也包括海水鱼类。目前对该菌引起的疾病在国内尚无有效防范措施。铁是一种细菌生存所必需的营养成分。在许多细菌中的研究表明，铁调控大量细菌蛋白的表达，这些蛋白参与各种生物功能，包括铁获取和运输、代谢反应以及致病过程等。在某些细菌中，位于细胞表面的铁调控蛋白参与细菌感染过程并具有免疫保护作用。目前荧假单胞菌铁调控蛋白的研究很少，其作用也不甚清楚。

发明内容

本发明目的在于提供荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用，铁调控蛋白用于制备荧光假单胞菌的免疫疫苗。所述铁调控蛋白为质粒pETTfeR或pETOprF。

进一步的说，以荧光假单胞菌TSS1为模板，采用F1/R1或F2/R2为引物分别进行PCR扩增,PCR产物分别与载体pET259连接，获得质粒pETTfeR或pETOprF，所得质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)即可表达重组铁调控蛋白。

所述引物为F1：5’-GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3’；R1：5’-GATATCCGATGTAGTCACCGACGCGAA-3’；F2：5’-GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3’；R2：5’-GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3’。

本发明具有如下优点：

1.显著保护性。本发明的荧光假单胞菌铁调控蛋白作为疫苗对荧光假单胞菌的免疫保护效率达50％以上。

2.本发明的疫苗无需商业化佐剂。

附图说明

图1为本发明实施例提供的纯化的铁调控蛋白(泳道1)。泳道M，分子量标准。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1

荧光假单胞菌铁调控蛋白TfeR和OprF的表达受铁条件调控

荧光假单胞菌TSS1在正常LB培养基(对照组)或含有600uM铁络合物2,2’-dipyridyl(购于美国Sigma公司)的LB培养基中摇动培养2h，培养温度为28℃，转速160rpm。随后以5000g，4℃离心10min，收集菌体。将收集的菌体进行荧光定量PCR检测TfeR或OprF基因的表达(具体方法见文献：Zhang SR,Zhang L,Sun L.Identification and analysis of three virulence-associated TonB-dependent outer membrane receptors of Pseudomonas fluorescens.Dis Aquat Org.2014；110:181-91.)。结果表明，在铁络合物2,2’-dipyridyl的存在下，TfeR和OprF基因的表达量显著(P<0.01)上调(即检测到的TfeR和OprF的mRNA量显著增多)(分别为对照组的14倍和30倍)，说明这两个基因受铁条件调控。