[发明专利]一种光滑念珠菌荧光PCR 检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及荧光PCR检测试剂盒领域，更具体涉及光滑念珠菌荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

近年随着免疫抑制剂在在临床上的广泛应用和艾滋病疫情的蔓延，光滑念珠菌(Candida Glabrata，CG)在临床检出率明显增加，在某些地区已成为仅次于白色念珠菌的第二大念珠菌感染病原体。而光滑念珠菌对常用的抗真菌药物如三唑类药物敏感性低，因此其引起感染的治疗较为困难，导致的系统性感染病死率高。

光滑念珠菌感染作为一种常见的侵袭性的真菌感染，具有危害大，病程进展快，预后差，给感染者的身体健康甚至生命带来严重威胁等特点，临床上主要通过直接涂片镜检、组织病理学方法、影像学方法、血清学方法等检测光滑念珠菌的感染，传统的培养鉴定方法和组织病理学方法是诊断侵袭性真菌感染的金标准。但血培养和涂片直接镜检阳性率较低；组织病理学方法为确诊的重要手段，但需要进行有创操作，对于白血病化疗、粒细胞极低甚至缺乏的患者无疑会提高感染的风险，临床应用具有局限性；高分辨率CT对侵袭性性真菌感染特别是肺部真菌感染的诊断具有一定的临床价值，但影像学表现较临床表现有延迟，而且特异性差、无法作为真菌感染确诊证据。

近年来以DNA为基础的PCR分子生物学检测方法因快速、准确而倍受关注，成为探索的热点，主要包括巢式PCR(nest PCR)、实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantify PCR)等。由于实时荧光定量PCR在速度、操作、特异性等多方面存在众多优势，因此临床上其中光滑念珠菌感染早期诊断领域的应用愈加广泛，给临床诊断和治疗带来了重要的指导意义。

运用荧光PCR技术检测光滑念珠菌DNA主要包括光滑念珠菌核酸提取和核酸PCR扩增两方面。

目前国内临床上主要采用机械破碎法对光滑念珠菌核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，反复高速震荡和高速离心，再取上清为模板。机械破碎法的优点在于对于样本中的PCR抑制物去除较彻底，但存在步骤繁琐，操作时间长，对于操作人员技术水平要求高和需添置专门的设备等不足之处。

临床上检测CG-DNA的方法目前主要是基于实时荧光定量PCR的技术及其改进，实时荧光定量PCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，使用一种带有荧光检测装置的PCR扩增仪，荧光检测装置能够按照一定的程序周期性地发出特定波长的激发光，收集检测荧光信号，通过检测荧光信号的动态变化实时反映PCR的每个循环的扩增水平，试验结束后可通过软件自动分析获得扩增曲线，根据扩增曲线与荧光阈值线的交点(即Ct值)以及扩增曲线的形状，可以判断阴阳性结果；如果同一反应中有已知浓度的定量参考品或标准品，则可以通过软件自动分析获得标准曲线，由此实现对未知样本的定值(即定量检测)。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光能量被淬灭基团吸收，呈现淬灭效应；如果扩增过程中有靶序列的存在，随着目标片段的延伸，探针分子逐渐被Taq酶水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光能量转移效应，荧光报告基团发出的荧光信号被荧光检测装置收集。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。试验结束后，可以通过荧光PCR仪自带的软件自动分析数据，可以获得阴阳性结果和样本浓度的定值结果，因此，该技术在靶多核苷酸样品的检测和定量分析中，已逐渐取代传统的PCR方法，得到十分广泛的应用。

国内已有基于实时荧光定量PCR技术定量检测CG-DNA的试剂盒应用于临床检测中，但这些试剂盒所提供的CG-DNA提取方法存在下述不足之处：核酸提取过程较复杂，样本处理耗时长，且在处理样本时，样本中的DNA存在损耗，尤其对于高浓度的样本，裂解不充分、富集不完全，会造成DNA的大量丢失导致样本定量偏低。此外，这些试剂盒中的荧光定量PCR技术定量检测CG-DNA的引物、探针序列的选择也会影响最终检测的特异性和灵敏度(例如某些弱阳性样本经常无法扩增和检出)。

正因为现有技术中的核酸的提取和核酸的扩增检测步骤的缺陷使得现有技术中的CG-DNA检测灵敏度不高。因此，本领域需要解决现有光滑念珠菌荧光定量PCR检测试剂盒的缺陷，提供一种操作快速、方法简便、检测灵敏度高、检测范围宽的光滑念珠菌荧光定量PCR检测试剂盒。

发明内容