[发明专利]一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一株能稳定高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用。

背景技术

各种神经损伤和神经系统退行性病变(如老年痴呆、帕金森病等)一直是困扰人类的一大疾患，且这类疾患呈现出高发生率、高致残率、高耗费、低死亡率等特点，给社会和家庭带来了沉重的负担。治疗各类神经系统疾病和神经损伤的关键是提高受损神经的修复能力，众多的实验表明，各类神经营养因子可以为神经再生提供良好的微环境，在防止神经细胞的退变和促进神经突起的生长方面均起着十分重要的作用。

Neuritin(CPG15，NRN1)是近年发现的神经营养因子，在神经突触可塑性、保护受损神经元和促进神经再生过程中有重要的作用。因此，获取高纯度且具有天然活性的Neuritin蛋白对治疗各种神经退行性疾病如老年痴呆症、阿尔茨海默病等有着良好的应用前景。利用基因工程技术制备大量Neuritin重组蛋白，是生物学功能研究和临床需要的基础。

当代医学对神经系统疾病和神经损伤还缺少有效的治疗和/或预防的药物。

发明内容

有鉴于此，为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一株能稳定高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一株高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株——巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，所述巴斯德毕赤酵母GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，其保藏编号为CGMCC NO：9912。

本发明的高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株命名为巴斯德毕赤酵母GS115-pPIC9K-neuritin-1-20110415，其于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC NO：9912。

在其中一些实施例中，所述Neuritin截短体蛋白为缺少信号肽和GPI锚定位点的可溶性蛋白。

本发明还提供了上述高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株的应用。

在其中一些实施例中，所述应用为所述重组菌株表达的Neuritin截短体蛋白在促进坐骨神经损伤后再生修复的药物制备中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株能稳定高表达Neuritin截短体蛋白的毕赤酵母重组菌株，并对其表达的蛋白制定了活性单位。与目前市场上所售的大肠杆菌表达的Neuritin截短体蛋白相比，真核细胞表达的外源蛋白具有翻译后修饰的生物活性，且外源基因稳定整合于酵母染色体内，能稳定传代且易于规模化培养等优点。通过动物实验发现：Neuritin能够促进损伤后早期坐骨神经的再生和功能恢复，为外周神经损伤的治疗提供了一个新的方法，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中的SDS-PAGE筛选高表达菌株表达Neuritin蛋白的图谱；

图2为本发明实施例2中的SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白的图谱；

图3为本发明实施例3中western-blot鉴定Neuritin与His标签结果；

图4为本发明实施例3中Neuritin截短体蛋白对PC12细胞的作用，其中A为阴性对照(PBS)；B为阴性对照组(6×His，20μg/ml)；C为实验组(Neuritin，20μg/ml)；

图5为本发明实施例3中Neuritin截短体蛋白对鸡胚背根神经节细胞的作用；其中A为空白对照组(10×)，B为阴性对照组(6×His，20μg/ml,10×),C为阴性对照组(BSA，20μg/ml,10×)，D为实验组(Neuritin，24μg/ml，10×)；

图6为实施例4的不同时间段各组实验大鼠SFI恢复趋势图；

图7为实施例4的不同时间段各组实验大鼠NCV恢复率比较结果图；

图8为实施例4的不同时间段各组实验大鼠肌张力的结果图；

图9为实施例4在第4周各实验组的神经HE染色的结果图(200×)，其中：A为生理盐水组，B为Neuritin 5μg组；

图10为实施例4在第4周不同实验组的神经髓鞘染色的结果图(400×)；其中：A为生理盐水组，B为Neuritin 5μg组；