[发明专利]植物苯丙氨酸解氨酶活性测定用试剂体系及测定方法

权利要求书

1.一种植物苯丙氨酸解氨酶活性测定用试剂体系，其特征在于：

该试剂体系包括以下试剂：缓冲液、试剂1、试剂2、试剂3、试剂4、终止液1、终止液2和校准溶液，

所述试剂体系组成按摩尔浓度如下：

缓冲液：10～200mmol/L、pH 8.0～9.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液或硼酸-硼砂溶液；

试剂1：L-苯丙氨酸10～200mmol/L，用上述缓冲液作为溶剂配制；

试剂2：琥珀酸0～200mmol/L，用上述缓冲液作为溶剂配制；

试剂3：甘氨酰-L-亮氨酸0～50mmol/L，用上述缓冲液作为溶剂配制；

试剂4：茚三酮10～100mmol/L，用上述缓冲液作为溶剂配制；

终止液1：盐酸6.0mol/L，用上述缓冲液作为溶剂配制；

终止液2(碱性铜溶液)：酒石酸钾钠0.1～100mmol/L、碳酸钠10～500mmol/L、硫酸铜0.01～100mmol/L，用上述缓冲液作为溶剂配制；

校准溶液：20mmol/L的L-苯丙氨酸标准溶液，用上述缓冲液作为溶剂配制。

2.一种采用如权利要求1所述的试剂体系的植物苯丙氨酸解氨酶活性测定方法，其特征在于：

包括如下步骤：

a)酶液提取

称取植物样品，加入经预冷的缓冲液，其中，样品(质量)与缓冲液(体积)的质量体积比为1～2：1～5，冰浴研磨匀浆后，离心，收集上清液作为苯丙氨酸解氨酶液备用；

b)酶促反应

将试管分为初始管、终止管、标准管，在初始管和终止管中分别加入缓冲液、试剂1和步骤a中提取的苯丙氨酸解氨酶液，混合，其中，缓冲液、试剂1和苯丙氨酸解氨酶液的体积比为10～40：1～10：1～10；

在标准管中加入与在初始管和终止管中所加入的缓冲液相等体积的缓冲液、与在初始管和终止管中所加入的试剂1相等体积的校准溶液、与在初始管和终止管中所加入的苯丙氨酸解氨酶液相等体积的缓冲液，混合；

将初始管置于30～50℃水浴后，立即加入终止液1，混合得到初始管反应液，流水冷却至室温，加入的终止液1与初始管反应液的体积比为1～5：12～48；

将终止管置于30～50℃水浴保温30～90min后，加入与初始管中相等体积的终止液1，混合得到终止管反应液，流水冷却至室温；

在标准管中加入与初始管中相等体积的终止液1，混合得到标准管反应液；

c)酶活性测定

依次将试剂2、试剂3、试剂4分别加入到初始管反应液、终止管反应液和标准管反应液中，混合得到初始管混合液、终止管混合液和标准管混合液，其中试剂2、试剂3、试剂4与初始管反应液的体积比为0～30：0～6：2～50：700～6500，试剂2、试剂3、试剂4与终止管反应液的体积比为0～30：0～6：2～50：700～6500，试剂2、试剂3、试剂4与标准管反应液的体积比为0～30：0～6：2～50：700～6500；

将初始管混合液、终止管混合液和标准管混合液置于50～70℃水浴保温20～80min，取出，流水冷却4～6min；

在冷却后的初始管混合液、终止管混合液和标准管混合液中分别加入等体积的终止液2，混合得到初始管终止液、终止管终止液和标准管终止液，终止液2与初始管混合液的体积比为10～300:245～6545，终止液2与终止管混合液的体积比为10～300:245～6545，终止液2与标准管混合液的体积比为10～300:245～6545；

将初始管终止液、终止管终止液和标准管终止液置于室温下避光温育，分别测定、记录初始管终止液、终止管终止液和标准管终止液荧光强度数值；

d)苯丙氨酸解氨酶活性计算

以单位时间单位质量样品苯丙氨酸解氨酶在反应体系中消耗1μmol L-苯丙氨酸为1个苯丙氨酸解氨酶活性单位，计算公式为：

3.如权利要求2所述的植物苯丙氨酸解氨酶活性测定方法，其特征在于：

步骤c中，温育时间为20～30min，测定条件为激发波长350～380nm，发射波长450～520nm。