[发明专利]一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及重组基因表达系统，具体而言，本发明涉及在细胞内稳定表达人工改造后，具有核定位信号的人巨细胞病毒pp65基因及其应用。

背景技术

人巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV）在人群中的感染极为普遍，呈世界性分布，国内约90%成人可检出HCMV抗体。已知人类的HCMV初次感染（又称原发感染）通常发生在2岁以内，且一旦感染，病毒难以被清除体外，大多终身潜伏于宿主机体中。在免疫功能正常的人群，该病毒与宿主处于“平衡”状态，当机体由于各种原因导致免疫力低下时（HIV感染、移植和衰老等），这种“平衡”就会被打破引起HCMV再激活感染，此时的病毒可以来自宿主本身也可以来源于其他感染者。原发感染和再激活感染统称活动性感染, AIDS患者、移植受者和老年人中，HCMV活动性感染可引起多种疾病，甚至导致死亡；在免疫功能尚未发育成熟的胎儿则有致畸性，导致出生缺陷。

目前还没有可预防HCMV感染的疫苗，但临床研究已发现，早期抗病毒治疗可以减轻先天性感染儿童神经系统损伤，挽救听力；可以降低移植患者病死率、避免过度免疫抑制治疗；并可预防艾滋病患者视网膜病变，有助于提高患者的生活质量。因此，临床急需快速、准确的HCMV活动性感染检测手段。常规病毒分离培养虽是HCMV诊断的“金标准”，但需4周才能获阳性结果，难以满足快速诊断的要求。ELISA法检测HCMV特异性IgM 抗体可用于免疫功能正常的HCMV活动性感染或HCMV病的诊断，但其阳性率低，在严重免疫抑制患者还可因缺乏抗体反应或抗体延迟出现而“误诊”。HCMV pp65为被膜蛋白，位于该病毒的衣壳和其包膜之间，属于低基质磷酸化蛋白，分子量为65kD，占病毒总蛋白的15%，是激发机体细胞免疫的主要病毒蛋白。由于HCMV主要潜伏于人外周血单个核细胞，发生再激活感染时，病毒首先在单个核细胞中复制增殖，再随血流播散引起体液免疫反应。因此，单个核细胞中pp65抗原出现的时间较特异性IgM抗体出现早，且不会因为患者免疫功能低下而表达降低。同时检测出pp65抗原血症不仅可以说明存在HCMV再激活感染，也可以说患者缺失针对HCMV的细胞免疫力。因此，通过检测患者HCMV pp65抗原血症是新近被临床广泛接受的检测HCMV活动性感染的“新金标准”。鉴于此，建立pp65抗原血症检测试剂盒将会有效帮助临床解决HCMV活动性感染诊断问题。

然而作为临床诊断使用的HCMV pp65抗原血症检测试剂盒需要准确可靠的阳性对照，HCMV在体外难以感染单核细胞，因此不能采用体外感单核细胞染细胞的方式制备阳性对照；在大多数患者体内HCMV pp65抗原血症阳性的细胞数目较少（小于1%），因此直接以已知阳性患者的单核细胞作为阳性对照也难以实现；若将pp65基因直接转染细胞，pp65蛋白会表达与细胞浆中，这与HCMV感染时pp65表达与细胞核中存在明显差异，因此也不能作为对照。

发明内容

本发明的目的是建立核内稳定表达HCMV pp65基因的K562细胞，用作HCMV pp65抗原血症检测试剂盒阳性对照。

本发明的目的是通过以下方案实现的：

    一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法:包括以下步骤：

a)    采用套叠PCR获取3-’端增加核定位信号的人巨细胞病毒pp65基因；

b)    将该基因克隆至慢病毒表达载体PLVX-puro中，并包装表达pp65-NLS基因的慢病毒；

c)    用表达pp65-NLS基因的慢病毒感染K562细胞；采用嘌呤霉素筛选出稳定表达pp65-NLS基因的K562细胞株。

    所述的一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法,其特征在于:pp65-NLS基因是通过套叠PCR在正常人巨细胞病毒pp65基因3-’端增加核定位信号NLS。

    所述的一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法,其特征在于:核定位信号的氨基酸残基序列为DPKKKRKVDPDPKKKRKVDPKRKVGSTGSRGT。

    所述一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法,其特征在于:其中pp65基因表达在细胞核中，与人巨细胞病毒感染细胞时pp65蛋白在受感染细胞中的定位一致，而与直接转染pp65基因只会表达在细胞浆中不同。

    所述一种核内稳定表达人巨细胞病毒pp65蛋白K562细胞株的制备方法,其特征在于: