[发明专利]一种大鼠肝细胞分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物领域，尤其涉及一种大鼠肝细胞分离方法。

背景技术

肝细胞不仅在基础研究中有着重要的作用，而且在医学相关领域中得到极为广泛的应用。肝细胞移植也是治疗急性肝功能衰竭、肝硬化，遗传代谢性肝病的有效方法和作为等待原位肝移植的过渡治疗，因此肝细胞悬液的质量至关重要。如何能通过较为简单的方法获得大量有活性的肝细胞，一直是进行基础研究和临床研究亟待解决的重要问题。长期以来，国内外普遍采用Seglen两步灌流法，但该类方法仍存在胶原酶价格昂贵、消耗量大，而且获得的肝细胞悬液多细胞团块。

发明内容

本发明的目的是提供一种大鼠肝细胞分离方法，操作简单、胶原酶使用量少、细胞产量及成活率高。

为了解决上述技术问题，本发明提供的大鼠肝细胞分离方法是这样实现的：

一种大鼠肝细胞分离方法，包括步骤：（a）取出大鼠肝脏；（b）预热35~38℃的无钙灌流液灌流，直到肝脏胀大；（c）剪断肝下下腔静脉，使血液流出，直到肝脏成土黄色；（d）预热的35~38℃含钙灌流液灌流3~7min；（e）预热35~38℃的含0.05%Ⅳ型胶原酶的灌流液灌流1~3min；（f）止血钳夹住肝下下腔静脉，0.05%Ⅳ型胶原酶继续灌流，待肝脏胀大时停止灌流，原位消化4~6min，原位消化期间不间断使用35~38℃生理盐水淋在肝脏上；（g）去除止血钳，预热35~38℃的含0.05 %Ⅳ型胶原酶的灌流液灌流2~3min；继续执行步骤（f）和步骤（g），当肝脏表面出现裂纹时，执行步骤（h）；（h）分离肝脏，撕开肝包膜，将肝细胞收集到3~5℃含钙灌流液中，过滤，收集滤液；（i）将收集的滤液3~5℃低速离心，弃上清，加含钙灌流液，重悬，重复2~4次；（j）将离心收集的细胞在细胞培养皿中培养，每4h，换液。

可选的，所述无钙灌流液为：HEPES：2.00~3.00g/L，NaCl：7.00~8.00 g/L，KCl： 0.20~0.30 g/L，NaH2PO4·2H2O：0.10~0.20 g/L，D-葡萄糖：1.50~2.50 g/L，EGTA：0.15~0.25 g/L。

可选的，所述含钙灌流液为：HEPES：2.00~3.00 g/L，NaCl：7.00~8.00 g/L，KCl：0.20~0.30 g/L，NaH2PO4·2H2O：0.10~0.20 g/L，D-葡萄糖：1.50~2.50 g/L。

可选的，所述含0.05 %Ⅳ型胶原酶的灌流液为：胶原酶IV溶于预冷的含钙灌流液中制成，胶原酶IV与含钙灌流液的配比为：0.5g/l；使用时，稀释10倍。

可选的，所述预冷的含钙灌流液中预冷的温度为3~5℃。

可选的，所述步骤（b）中无钙灌流液灌流的流速为：18~22 ml/min。

可选的，所述步骤（d）中含钙灌流的灌流流速为：18~22 ml/min。

可选的，所述步骤（e）中含0.05%Ⅳ型胶原酶灌流的灌流时间为，流速为：13~17 ml/min；所述步骤（f）中0.05%Ⅳ型胶原酶灌流的灌流的流速为：13~17 ml/min；所述步骤（g）中0.05%Ⅳ型胶原酶灌流的流速为：13~17 ml/min。

可选的，所述步骤（i）中低速离心的离心速度为：600 r/min，离心时间为：4~6min。

可选的，所述步骤（j）中培养条件为：35~38℃、4~6%CO₂。

本发明提供的大鼠肝细胞分离方法，灌流液有三种，其基本成分都是相同的，细胞洗涤液也用灌流液，可使细胞处于一个稳定的状态中；因此相对于现有技术中Seglen两步灌流法，本发明操作简单、胶原酶使用量少、细胞产量及成活率高；且胶原酶灌流时，如步骤（f）、步骤（g）中记载采用的是间断灌流，节省灌流液，且步骤（f）中35~38℃预热的生理盐水的使用能维持肝脏细胞的温度，维持胶原酶的温度，使其活性最高，胶原酶利用率高；相对于现有技术的灌流方法，本发明成本低。

进一步的，本发明无钙灌流液和含钙灌流液中加入了HEPES和D-葡萄糖，HEPES有防止PH迅速变动的特性，使得在灌注过程中的肝细胞稳定于生理范围内，D-glouse能给细胞提供能量；无钙灌流液中加入了EGTA，EGTA与Ca(2+)形成的配合物的稳定常数比EDTA大；而且使用含钙灌流液进行灌流不仅可以将肝组织中的无钙灌流液中的EGTA螯合、去除，而且可以为胶原酶消化提供钙离子，胶原酶活力更高。

附图说明

图1是刚分离的大鼠肝细胞图；