[发明专利]基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于，包括步骤：

A：制备抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体过程

小鼠免疫：以基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白为抗原结合等体积的弗氏完全佐剂对第一小鼠和第二小鼠进行免疫；

杂交瘤细胞株生成：取血清抗体效价达1×10⁶以上的小鼠，无菌取小鼠脾脏制成细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株混合形成组合液，将聚乙二醇溶液加入所述组合液，产生抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体的杂交瘤细胞并选取强阳性杂交瘤细胞进行克隆化，获得一株M2丙酮酸激酶33.26的杂交瘤细胞株和一株M2丙酮酸激酶31.1的杂交瘤细胞株；

单克隆抗体生成：在第一小鼠体内接种M2丙酮酸激酶33.26的杂交瘤细胞株制备腹水获得单克隆抗体33.26，在第二小鼠体内接种M2丙酮酸激酶31.1的杂交瘤细胞株制备腹水获得得到单克隆抗体31.3；

B：量子点荧光探针的制备过程

对QD605溶液进行量子点活化；

经过量子点活化的QD605的溶液与抗人M2型丙酮酸激酶的单克隆抗体通过非共价偶联形成量子点荧光探针；

C：往结直肠癌细胞加入量子点荧光探针，并在共聚焦荧光显微镜下观察结直肠癌细胞的荧光图像或者通过计算机分析荧光图像以判断结果。

2.如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于：所述基因重组M2型丙酮酸激酶蛋白由携带M2丙酮酸激酶蛋白基因的大肠杆菌的工程菌株制配制而得。

3.如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于：小鼠免疫过程中，所述第一小鼠和第二小鼠为4-6周的雌性小鼠，对第一小鼠和第二小鼠进行第一次注射免疫时，采用弗氏完全佐剂与等体积M2丙酮酸激酶抗原混匀乳化，每只小鼠皮下多点注射30μg；以后每10天以弗氏不完全佐剂与等体积M2丙酮酸激酶抗原混匀乳化后对第一小鼠和第二小鼠进行注射免疫，一共注射免疫4次后，于融合前的3天，对第一小鼠和第二小鼠的腹腔注射M2丙酮酸激酶抗原100μg进行加强免疫。

4.如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于：单克隆抗体生成过程中，腹水的制备是分别在第一小鼠和第二小鼠腹腔内注射0.5ml弗氏不完全佐剂，使杂交瘤细胞能以腹水瘤形式在腹腔内生长；大约1～2周后，将2×10⁶个杂交瘤细胞悬浮于无血清RPMI1640培养基中，注入小鼠腹腔内制得。

5.如权利要求1所述的基于量子点标记的结直肠癌细胞的检测方法，其特征在于：所述强阳性杂交瘤细胞为阳性率达到100％的杂交瘤细胞。

6.一种试剂盒，包括包被捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的检测抗体、阳性对照、阴性对照和缓冲液，其特征在于：所述捕获抗体为权利要求1之5之一单克隆抗体33.26，所述的检测抗体为权利要求1-5之一单克隆抗体31.3。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述标记物为量子点、链霉亲和素、胶体金和缓冲液中的一种。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述标记物为量子点和链霉亲和素。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素结合有生物素化抗体受体，该链霉亲和素与生物素化抗体的比例为1∶40。