[发明专利]通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法

权利要求书

1.一种通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于它包括如下步骤：

A、种子前处理：选取成熟饱满、健康无病虫害的甘草种子，用98%浓硫酸浸泡39-41min后消毒；

B、取得无菌苗：取升汞处理过的刺果甘草种子用无菌水冲洗3-4次，接种到以MS培养基为基质的瓶中，于25℃温度下暗培养3d，之后每天以2000lux强度光照10h的光暗交替处理4天，后移至26℃温度下光培养，待植株生长到6-10cm时备用；

C、培养的健壮愈伤组织：将步骤B中的无菌苗，接种到玉米素混合培养基上，于23℃条件下暗培养5d，之后每天以2000lux强度光照16h的光暗交替处理；

D、处理刺果甘草愈伤组织：取步骤C培养的健壮愈伤组织，用0.05—0.2%浓度的秋水仙素处理16—24h；

E、继代培养：将处理过的愈伤组织接到玉米素混合培养基上进行第一次继代培养，20d后进行第二次继代培养。

2.根据权利要求1所述通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于：所述玉米素混合培养基的组成包括MS培养基、浓度为0.5mg/L的生长素萘乙酸和浓度为0.8mg/L6-反式-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基氨基嘌呤，在此基础上加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L、活性炭3g/L、聚乙烯吡咯酮0.5g/L，保持pH值为5.8。

3.根据权利要求1或2所述通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于：上述步骤A种子前处理中，甘草种子浸泡后，用 1%氯化汞消毒10min。

4.根据权利要求3所述通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于：步骤D中对刺果甘草愈伤组织用0.2%浓度的秋水仙素处理24h。

5.根据权利要求4所述通过组织培养使刺果甘草染色体加倍的方法，其特征在于：对步骤E继代培养的刺果甘草组织进行染色体倍性检测，具体步骤如下：取新生的愈伤组织于0.02%秋水仙素和0.002mol/L 8-羟基喹啉混合液中预处理2.5 h，冲洗干净，后用比例为3∶1的乙醇-冰醋酸固定液固定2 h；再用混合酶液在25℃恒温箱内处理3 h；用蒸馏水浸泡30min，去除蒸馏水后，再加入固定液固定半小时后制备细胞悬液，制片检测。