[发明专利]鉴别阿胶中多种动物源性的引物探针组合物、试剂盒及多重实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别阿胶真伪的方法，具体涉及一种鉴别阿胶中驴、马、猪及牛源性多重来源的引物探针组合物、试剂盒以及多重实时荧光定量PCR检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

阿胶在中国有数千年的历史，它是由马科动物驴的去毛之皮经熬制而成的胶状物，作为医疗保健价值广泛，具有补血养血、美容养颜、延年益寿、强筋健骨，增强免疫力等五大功能优势。从产品特征来看，正品阿胶一般为长方形块状，规则平整，大小厚薄均匀。它的表面为棕褐色或棕黑色，平滑有光泽，有纵纹，无气孔、油孔。质硬而脆，一拍即碎，碎片对光照略透明。气微香，味微甜，以棕褐色、光亮、透明、无腥臭、经夏天不软者为佳。砸碎后放入杯中，加沸水适量5分钟左右胶块即可溶化，胶液澄清无异物。除了块状固体阿胶，阿胶产品还包括阿胶口服液、阿胶固元膏、阿胶颗粒、即食阿胶等其他含有阿胶的制品。

作为阿胶原料驴皮，从生物分类学上看，驴（Equus asinus）属于奇蹄目马科驴属，包括非洲野驴、西藏野驴，中亚野驴及家驴等品种，其中中国饲养的家驴主要是：德州驴，凉州驴、云南驴及蒙古驴等众多地方种驴。

然而随着胶类市场的不断发展，随着熬胶原料供应的紧张和原料价格上涨，一些不法分子在利益的驱使下，用马皮、骡子皮、牛皮甚至猪皮等低廉皮张冒充驴皮现象越来越多，给医药保健品市场安全带来巨大隐患。为了取缔和预防假冒伪劣阿胶产品，需要质量监管部门加大执法力度，而首要前提是具备科学可靠的检测方法。

传统的阿胶鉴别方法主要靠感官检测，包括阿胶的色泽，切面纹理，水性，气味或风味等。但感官指标容易带来判断不准确、缺乏足够说服力等情况。

随着分子生物学技术的发展，一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起来，DNA分子法主要是利用显示生物特征的各种生物物种所具有的不同DNA序列信息进行鉴别，它可以突破依据感官检测的局限性，与传统分析方法相比，更加具有客观性和准确性。以聚合酶链式反应（PCR）为基础的技术已逐步成为了食品药品中动物源性成分种属鉴定的核心方法。近年来实时荧光PCR技术的飞速发展大大提高了检测的灵敏度、特异性和准确性，并使得成分含量的定量溯源成为可能，由于荧光定量整个检测过程为闭管操作，所以有效的减少了实验过程中的污染的危险，目前广泛应用于各个领域。

近年国内有科研机构开展了PCR-RFLP鉴定驴皮等动物皮张，但该方法只适用于动物皮而不适合成品阿胶鉴定，阿胶经过高温高压长时间作用，其DNA含量很少，均已降解为小片段，很难扩增出长片段的PCR产物。也有报道采用荧光定量PCR快速检测阿胶中牛源性，马源性、驴源性或猪源性成分，但都是单重源性的定性鉴定，目前还未见利用多重实时荧光PCR方法定性检测多种动物源性的报道。因此，建立一种利用多重实时荧光PCR方法同时鉴别驴、马、猪及牛源性的定性检测试剂盒将对阿胶及阿胶制品安全的快速监管具有重要的创新性的实践意义。

发明内容

针对现有技术中无法快速检测阿胶中多种动物源性的不足，本发明提供了一种能够同时鉴别阿胶中驴源性、马源性、猪源性及牛源性多种动物源性的引物探针组合物，该引物探针组合物特异性好，灵敏度高，可以实现阿胶中多种动物源性的快速定性鉴别。

本发明还提供了还有该引物探针组合物的试剂盒，该试剂盒使用方便、无污染。

本发明还提供了利用该引物探针组合物鉴别阿胶中驴源性、马源性、猪源性及牛源性成分的多重实时荧光定量PCR检测方法，该方法快速方便、准确度高。

为了达到同时检测阿胶中多种动物源性成分的目的，选择特异性好、灵敏度高的引物和探针是本发明的关键，为了克服多对引物对PCR反应体系带来相互干扰的弊端，本发明尽量采用少的引物。在引物设计方面，根据阿胶深度加工导致DNA高度降解的特点，采用哺乳动物线粒体DNA（mtDNA）作为分子标记，其原因在于mtDNA在遗传上相对独立，是双链超螺旋DNA大分子，具有基因组小、生物个体内无组织特异性但物种之间具有很高的遗传差异性、相比核基因拷贝数相当高等特点，因此用mtDNA分子标记鉴别动物源性成分与核DNA分子标记相比具有灵敏度高、精确度高、降解小（加工过程mtDNA保持相对完整）、稳定易操作等优势。此外，本发明通过比对驴、马、猪和牛的线粒体DNA序列，根据16srDNA基因保守区创新性的获得猪和牛2种动物共有的一对引物，以及马和驴共有的一对引物，同时在同源性相对低的区域设计上述四种动物的特异性荧光探针（即特异探针），大大减少了由多对引物对PCR反应体系带来的相互干扰。