[发明专利]农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种农杆菌介导茭白黑粉菌转化子菌株的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

1）制备真菌表达载体；

①PCR扩增真菌启动子gpdA或 hsp70的启动子片段，在5’加上BstXI位点，在3’加上ApaI位点，克隆至T载体；

②将pCambia1301载体上含AatII酶切位点的片段PCR扩增出来，在5’加上ApaI位点，在3’加上KpnI位点，然后克隆至T载体；

③将含有启动子片段的T载体用ApaI和KpnI酶切，将含AatII酶切位点的片段的T 载体用ApaI和KpnI酶切，将这两者连接，得到含有启动子和含AatII酶切位点的片段的质粒；用BstXI和AatII将启动子和含AatII酶切位点的片段切出，连接至用BstXI和AatII酶切过的pCambia1301载体，使得潮霉素基因前的35S启动子被替换；

④将步骤③获得的pCambia1301载体的EcoRI和SacI位点之间插入真菌hsp70启动子片段或gpdA 启动子片段，在SacI和PstI位点之间插入绿色荧光蛋白基因片段，在HindIII和PstI位点之间插入真菌的终止子trpc片段，得到真菌表达载体；

2）农杆菌感受态的制备；

①将-80℃保存的甘油菌株在含50mg/L Rif的LB平板上划线，在28℃下过夜培养活化；

②挑选平板上的单克隆，转入5ml 含50mg/L Rif的LB管中摇菌过夜；

③转移5ml菌液至100ml LB的摇瓶中，28℃下250rpm振荡培养4-5小时，定时测定菌液OD₆₀₀值，培养2小时后每30min测定一次，当OD₆₀₀值达到0.3-0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上充分冷却；

④菌液转到预冷的50ml离心管中，4℃，4000g以下离心15分钟；倒掉上清，用20ml预冷的无菌水洗涤重悬菌体；

⑤4℃，4000g离心20分钟后，用10ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；

⑥4℃，4000g离心20分钟后，用2-3ml预冷的10%甘油重悬浮菌体；

⑦按100μl等份装入预冷的1.5ml离心管中，于-80℃保存；

3）电转化农杆菌；

①于-80℃冰箱中取出感受态细胞100μl，冰浴化冻；

②取2μl纯化好的步骤1）的载体质粒，载体质粒浓度为10pg/μl，加入感受态细胞，冰浴5min，转入预冷的电极杯中，2500V电击；

③加入500μl的LB培养基在28℃摇床中200rpm恢复培养2小时；

④4000g离心5分钟，在超净台内将离心管中500μl上清去掉，剩余菌液用枪头吹打均匀，涂在含有50mg/L Rif以及50-100mg/L潮霉素的LB平板上；

⑤28℃培养箱放置2天，挑选单克隆菌落PCR验证；

⑥经鉴定后含有目标质粒的农杆菌加20%甘油保存于-80℃；

4）农杆菌介导的茭白黑粉菌的转化

①将-80℃甘油保存的含有目标质粒的农杆菌菌株在LB平板上划线，在28℃下过夜培养活化，所述的LB平板含有50mg/L Rif和50-200mg/L潮霉素；

②挑单克隆到5ml含有50mg/LRif和50-100mg/L潮霉素的LB培养基，摇菌；

③离心收集菌体，转入IM培养基中培养6小时至OD₆₀₀0.5，其中IM培养基加AS至 200μM；

④同时取从-80℃保存的茭白黑粉菌甘油菌株在YPD培养基上划线活化，挑选单克隆在5ml的液体YPD培养基上培养3天，转入新的YPD培养基中摇至OD₆₀₀0.5备用；

⑤以含有200μM AS的共培养培养基制备固体平板，其上放置一张混合纤维素膜，稀释农杆菌至OD₆₀₀为0.2，取100μl的茭白黑粉菌和100μl的农杆菌混合均匀涂布于纤维素膜上，25℃培养2天；

⑥将混合纤维素膜取出放于筛选培养基YPD上，培养基YPD中含有50-200ug/ml 潮霉素和200ug/ml特美汀，28℃培养3-5天，挑选生长的菌落做后续验证，验证其是否为转化子。