[发明专利]一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体、制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体、制备方法及其应用。

背景技术

新城疫病毒(NDV)属副粘病毒，其引起的新城疫(ND)是一种对世界养禽业危害极为严重的传染病。NDV的基因组编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)，融合蛋白(F)，血凝素-神经氨酶(HN)和RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(L)。另外,P基因还可通过RNA的编辑作用编码2种蛋白质：V蛋白和W蛋白，P，V，W蛋白具有相同的N端和不同的C端。研究表明,副粘病毒进入细胞后，首先转录产生mRNA，翻译出早期蛋白(NP，P蛋白)，二者与L蛋白共同组成病毒的核糖核蛋白复合体(RNP)之后，病毒mRNA才能翻译出其他晚期蛋白(F蛋白、HN以及M蛋白等)，进而组装成病毒粒子出芽。此外，P蛋白还能与未组装的前体NP结合，形成P-NP复合物，该复合物既可激活病毒基因组复制，也可阻止前体NP与病毒RNA非法组装形成核衣壳。由此可见，新城疫病毒进入宿主细胞后能否顺利复制增殖，其中能否形成RNP是最为关键的。因此，深入研究转录复合体(RNP)关键的P蛋白，无论是对于病毒复制增殖机制研究，还是新型抗病毒药物研发都是非常必要的。

胞内抗体技术是一种全新的可阻断细胞内靶蛋白功能的技术，它通过特异性干扰或阻断分布于该部位的某些生物大分子的活性或加工、分泌过程，引起细胞的一系列生物过程发生改变。根据胞内抗体的构建策略，将单链抗体克隆到真核表达载体，转染宿主细胞，使表达的胞内抗体定位于亚细胞区室。

发明内容

鉴于NDV转录复合体蛋白(RNPs)在病毒复制增殖过程中所处的关键环节，本发明构建了能够与新城疫病毒RNPs关键的P蛋白结合的胞内抗体，利用胞内抗体对RNPs进行抑制，可获得最大程度的抗病毒效果，为新城疫的预防和控制提供一种新的方法。

本发明技术方案具体阐述如下。

本发明提供一种鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体的制备方法，其通过将鸡源性抗NDV的P蛋白的单链抗体编码基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1，构建获得鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体。具体步骤如下：

(1)将鸡源性抗NDV的P蛋白的单链抗体scFv ZL1编码基因装入克隆载体pMD18-T中，构建克隆质粒pMD18-T-scFvZL1；

(2)将真核表达载体pcDNA3.1和克隆质粒pMD18-T-scFvZL1用HindIII和EcoRI限制酶进行双酶切，纯化回收；

(3)采用T4DNA连接酶将scFvZL1基因和pcDNA3.1(+)的双酶切回收片段连接，得到重组质粒pcDNA3.1-scFvZL1，即鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体。

本发明还提供上述制备方法得到的鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体。

进一步的，本发明提供上述制备方法得到的鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体用于制备预防和/或治疗新城疫药物。

本发明将鸡源性抗鸡新城疫病毒P蛋白的胞内抗体pcDNA3.1-scFvZL1转染BHK21细胞，通过提取细胞内RNA，分析胞内抗体的mRNA水平和抗体蛋白表达水平；并通过G418试剂获得尽可能多的含有胞内抗体的细胞。抗NDV的P蛋白的胞内抗体能与NDV的P蛋白在感染的宿主细胞内特异性结合，阻断了RNPs的形成，表现了显著的细胞内抗病毒活性，能够用于鸡新城疫的治疗。

附图说明

图1为胞内抗体重组质粒pcDNA3.1-scFvZL1。

图2为构建的胞内抗体真核表达质粒中scFvZL1基因及其表达产物序列。

图3为Western-blot分析单链抗体在转染细胞中的表达图。(1，阳性对照；2,3.胞内抗体；4.阴性对照。)

图4为H血凝实验(HA)实验检测胞内抗体对细胞的保护效果图。

具体实施方式

实施例1抗鸡新城疫病毒P蛋白的重组质粒(pcDNA3.1-scFvZL1)的构建

1、真核表达载体(pcDNA3.1)及克隆质粒(pMD18-T-scFvZL1)基因的酶切