[发明专利]流感病毒A型、B型联合检测引物、探针、试剂盒及应用

说明书

技术领域

本发明涉及流感病毒的分子生物学检测技术领域，具体涉及流感病毒A型、B型联合检测引物、探针、试剂盒及应用。

背景技术

流行性感冒病毒(influenza virus)，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。感染鸟类、猪等其它动物的流感病毒，其核蛋白的抗原性与人甲型流感病毒相同。

近年来发现流感不仅严重危害禽类、猪等动物，尤其是可以感染人并致人死亡，极大地威胁着人类公共卫生安全。流感病毒的遗传物质由8个大小不等的独立单股负链RNA片段组成。其中第7个节段即M基因全长为1027bp，编码2种蛋白M1和M2。在M基因编码的蛋白中，M1蛋白具有种群特异性，是病毒分类和诊断的基础。

目前，检测流感病毒的方法包括病毒的分离和培养、血清学诊断、免疫荧光法、酶联免疫吸附(ELISA)等，但这些方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。核酸检测技术由于灵敏性和特异性较高，已经成为流感病毒检测的常用方法。相比常规RT-PCR，荧光定量PCR技术(real-time RT-PCR)具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交叉污染并提高检测效率。

然而，目前基于RT-PCR检测流感病毒的方法都要进行病毒RNA提取，然后以RNA为模板进行检测。这一RNA提取步骤无疑大大增加了检测工作量、时间和成本，难以实现高通量检测。此外，提取RNA的过程仍容易发生RNA降解或交叉污染等事件；且对于痕量样本，提取RNA仍存在较大困难。因此，现有的基于RT-PCR检测流感病毒的方法还有待于改进和发展。

为了提高流感病毒检测效率、节省成本、避免交叉污染并进行高通量检测，一种较好的解决方案是设法实现流感病毒A型和B型直接扩增的RT-PCR检测，即直接以采集的液体样本作为检测对象进行RT-PCR反应，同时检测流感病毒A型和B型。然而，受限于引物和探针易受样本复杂因素的影响，目前还没有找到可以这样使用的引物和探针。

发明内容

本发明提供一种流感病毒A型、B型联合检测引物、探针、试剂盒及应用。本发明用于RT-PCR中，克服了传统RT-PCR需要提取RNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，可以同时检测流感病毒A型和B型，提高检测效率，节省成本，有效避免交叉污染，能进行流感病毒的高通量检测，对快速发现流感疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测引物，所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测探针，所述探针的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示。

作为本发明的优选方案，所述探针SEQ ID NO:3的3’端结合有BHQ1(Black Hole Quencher-1，黑洞淬灭染料-1)荧光淬灭基团，5’端结合有FAM(6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素)荧光报告基团；所述探针SEQ ID NO:6的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有ROX(Carboxy-X-Rhodamine)荧光报告基团。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种流感病毒A型、B型的RT-PCR联合检测试剂盒，所述试剂盒包括引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，所述探针的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所示。

作为本发明的优选方案，所述探针SEQ ID NO:3的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有FAM荧光报告基团；所述探针SEQ ID NO:6的3’端结合有BHQ1荧光淬灭基团，5’端结合有ROX荧光报告基团。

作为本发明的优选方案，所述试剂盒还包括反转录酶和Taq DNA聚合酶。优选地，所述反转录酶和Taq DNA聚合酶具体是直接RT-PCR酶混合物(Direct RT-PCR enzyme mix)的形式，即包含有反转录酶和Taq DNA聚合酶的混合物，可以直接用于RT-PCR反应中。