[发明专利]检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及莱克多巴胺检测技术，尤其是涉及一种基于 Fe₃O₄@β-CD 作为捕获探针、PtNPs/PV 作为信号探针的用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

β₂ 受体激动剂（β-adrenergic agonists）因可缓解哮喘症状,从而常被用作兽药；然而由于其能增长肌肉、减少脂肪蓄积等也常被添加到饲料中。莱克多巴胺（Ractopamine，RAC）作为 β₂ 受体激动剂的一员是一种人工合成的克仑巴安，正被作为一种新型瘦肉精在一些养猪场使用。我国农业部、卫生部、国家食品药品监督局联合发布的《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》中规定禁止莱克多巴胺作为生长促进剂在饲料中使用。因此，亟需一种快速、高灵敏的莱克多巴胺痕量残留检测方法作为保证食品安全的重要手段。

目前，大量的检测手段已经研究并用于莱克多巴胺的检测，其中较精确可靠的如气相色谱（GC）、液相色谱（LC）以及它们与质谱联用（GC-MS、LC-MS）。但它们都存在仪器操作复杂、仪器昂贵、耗时长等问题，这些问题使得它们很难用于现场快速筛查。快速检测试纸条虽然方便但仅能做到定性，不能定量。同时，传统的莱克多巴胺 ELISA 检测试剂盒一般使用竞争法，虽然快捷有效，但仍存在检测限太高、假阳性等缺点。目前国内外还没有公开任何关于利用 Fe₃O₄@β-CD 作为捕获探针、PtNPs/PV 复合物作为酶标抗体用于检测莱克多巴胺的免疫比色法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、准确性和灵敏度高、特异性强且易于操作的用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒及其制备方法和应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒，包括酶标板和信号探针，所述的酶标板固定有莱克多巴胺抗原和捕获探针Fe₃O₄@β-CD，所述的信号探针为负载了大量 PtNPs 的 PtNPs/PV 的复合物，标准品为莱克多巴胺标准品，抗体工作液为抗莱克多巴胺抗体单克隆抗体，显色液A、显色液B为显色剂DAB，终止液为2M HCl或者2M H₂SO₄，洗液是PBST缓冲液。

一种用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒的制备方法，具体步骤如下：

（1）Fe₃O₄-NH₂ 的制备

将无水醋酸钠、己二胺（1,6-hexanediamine）和FeCl₃?6 H₂O混合后加入到乙二醇中，于42-60℃条件下搅拌得到铁源溶液，将铁源溶液转移到马弗炉中，于195-205 ℃条件下反应6-8h后，用磁铁分离，再分别用水和乙醇冲洗2-3次，除去未完全反应的溶剂，得到粒径为15-25 nm的Fe₃O₄-NH₂ 磁性纳米颗粒；

（2）Fe₃O₄@β-CD 的制备

将羟基琥珀酰亚胺（NHS）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）添加到含羧甲基化β-环糊精（carboxymethyl-β-CD，CM-β-CD）质量浓度为1wt%的PBS溶液（pH = 7.4）中，在室温下搅拌过夜后（以活化β-环糊精上的羧甲基），再加入步骤（1）制备得到的Fe₃O₄-NH₂ 磁性纳米颗粒，连续搅拌5-7h后，用磁铁分离，再用去离子水反复清洗，以除去未反应的化学物质，得到的Fe₃O₄@β-CD；

（3）PtNPs的制备

将2ml 1wt%的氯铂酸溶液加入到烧杯中轻搅4-6min后，迅速加入5ml 10mmol/L的硼氢化钠溶液还原，室温下剧烈搅拌，反应结束后通过于10000-12000r/min离心15-25min除去杂质，水洗至少3次后定容至2ml得到PtNPs溶液，在4℃条件下保存备用；其中烧杯经王水浸泡；

（4）PtNPs/PV复合物信号标签的制备