[发明专利]一种高效生产具有免疫活性的胞外多糖的南极海冰菌

说明书

技术领域

本发明属于功能微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种高效生产具有免疫活性的胞外多糖的南极海冰菌。

背景技术

多糖是一种无细胞毒的免疫促进剂。多种多糖能够分别或同时刺激巨噬细胞、B细胞、T细胞、自然杀伤细胞(NK)，增强这些细胞的活性；促进巨噬细胞分泌白细胞介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)；促进T淋巴细胞产生白细胞介素2(IL-2)；激活白细胞产生干扰素；调节抗体和补体生成等。多糖能对免疫系统发挥多方面的调节作用，从而改善机体的免疫功能。而微生物来源的多糖，尤其是细菌和真菌的胞外多糖，因其易于分离纯化而且产量高等优点在工业生产中颇受人们青睐。

南极微生物(海冰微藻和细菌)分泌产生大量的胞外多糖(EPSs)，这些物质聚集在冰藻和细菌生存的海冰通道中，提供了海冰和冰水界面的有机碳，是能源传输的主要物质。除了其生态学上的作用，国内外学者开始关注胞外多糖的生物学活性。极地细菌胞外多糖由于富含糖醛酸羧基基团、氨基糖氨基化合物、硫酸盐和羟基基团，特别是高比例的羟基基团和硫酸化程度，使得这些多糖具有独特的生物活性。但由于南极微生物生长速度慢、EPSs产量低且稳定性差，因而限制了其开发应用。因此，有必要从筛选出产量更高，更稳定的菌株。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效稳定生产胞外多糖的菌株以及其应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明的紫外诱变南极菌株为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)NJS2-UV3，于2014年12月23日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10239。

本发明的菌株在发酵制备胞外多糖中的应用；分离的胞外多糖其特征为白色絮状物，易溶于水和二甲基亚砜，相对分子量为60kDa，主要由阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖组成，其组成比为：阿拉伯糖：甘露糖：葡萄糖＝26：40：21。

本发明另一方面提供一种上述菌株发酵制备胞外多糖的方法，包括有如下的步骤：

1)种子液制备：

将菌株接种入培养基后培养获得终止液，其中培养基的一种具体组成如下：蔗糖2.25％(m/v)，豆粉1.05％，K₂HPO₄0.02％，Na₂SO₄0.01％，FeS0₄·7H₂O 0.001％，CaCO₃0.2％，pH值7.2，l2l℃灭菌20min；培养条件如下：10℃、120rpm，培养48h。

2)深层发酵制备胞外多糖发酵液

按种子液按照5％的比例接入到发酵培养基中，发酵温度为25±1℃；搅拌速度250r/min，用灭菌豆油作为消泡剂来消除在搅拌过程中产生的气泡。其中发酵培养基的一种具体组成如下：蔗糖4.5％，豆粉2.1％，K₂HPO₄

0.02％，Na₂SO₄0.01％，FeS0₄·7H₂O 0.001％，CaCO₃0.2％3)胞外多糖发酵液的后处理

将发酵液以10000r/min转速离心10min去菌体，将去菌体发酵液加入三倍体积的95％乙醇沉淀过夜后，以5000r/min离心收集沉淀；采用TCA法脱蛋白，南极菌NJ-S2胞外多糖溶液中加入1.5倍体积的10％TCA溶液，混合均匀，于冰箱中静置4～6h，再以5000r/min的转速离心15min，除去沉淀，保留上清液，如此反复处理数次，得多糖粗品。多糖粗品复溶，经过凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，冷冻干燥，得到多糖纯品。

本发明采用50S的紫外照射时间对南极菌Psychrobacter sp.B3进行诱变筛选，诱变后菌株的最适生长温度由10℃增加到25℃，从而有效的降低了生产能耗，而且菌株生长速度大大提高；诱变后单位体积发酵液中多糖含量由1.02g/L提高到9.98g/L，因而具有较高的开发利用价值。

附图说明

图1：紫外诱变的致死曲线图；

图2：紫外诱变筛选正向突变菌株UV3的培养图。

具体实施方式