[发明专利]一株产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2及其筛选和培养方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2。本发明还涉及该镰刀菌YL2的筛选和培养方法，其具有较好的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和微晶纤维酶活。

背景技术

纤维素是植物体的主要组成成分，约占植物体干重的33.4~50%，据估计，全世界平均每年大约可以生成近1000亿吨的植物纤维素类物质。纤维素是由多个葡萄糖残基以β-1,4-糖苷键相互连接而成的线性直链聚合大分子多糖，可以在多种水解条件下（如酸解、碱解、酶解等）连续断键、解聚，最终分解成为最小单元的葡萄糖。因此，在石油资源日益紧张的国际环境中，利用纤维素降解生产的生物燃料己受到普遍关注。但是纤维素很难被分解利用，如何将纤维素转化为能直接利用的资源和能源是摆在人们面前的一个难题。纤维素的降解有两条途径：化学法和生物酶法，化学法是指在酸或碱性环境下水解成低分子量的糖，但是产品纯度低、生产过程污染环境；生物酶法是通过纤维素酶等生物质降解纤维素，可克服化学法的缺点。纤维素酶（cellulase），又称纤维素酶系，属于糖苷水解酶，能水解纤维素β-1,4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和葡萄糖，是协同作用的多组分酶系。纤维素酶的主要组分是内切β-1,4-葡萄糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，前两种酶主要溶解纤维，后一种酶将纤维二糖转化为葡萄糖，当这三种主要成分活性比例适当时，就能完成纤维素的降解。

利用微生物产生的纤维素酶降解纤维类物质，反应条件温和，易于控制，对环境无污染，有利于促进人类社会的可持续发展，尤其是在生物能源方面的应用前景广阔。纤维素酶的获得是通过纤维素酶产生菌的发酵来得到，而目前存在的问题是纤维素酶的酶活力不高，酶解效率低。选育优良菌种是提高纤维素酶活力的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种产酶能力强、酶活性高的纤维素酶产生菌。本发明要解决的另一个技术问题是纤维素酶产生菌的培养方法。

一株产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2，Fusarium sp.YL2,于2014年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，位于中国·武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2014551。

本发明的纤维素酶产生菌具有较好的纤维素酶产酶能力，其具有较好的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活和微晶纤维酶活。

一株产纤维素酶的诱变菌株镰刀菌YL2的筛选方法，其步骤为：

（1）菌种活化：

将出发菌株镰刀菌ATCC 11599转接PDA斜面培养基，28～32℃恒温培养3～4d；出发菌株镰刀菌ATCC 11599 ，Fusarium sp. ATCC 11599，购于美国模式培养物集存库ATCC；

选择生长良好的活化斜面菌种转接于装有种子培养基的三角瓶中，于28～33 ℃，200±20 rpm下振荡培养36 h；

吸取经培养的种子培养液在10000 rpm下离心5 min，弃上清液；

以生理盐水重新悬浮沉淀并将其转入带有玻璃珠的三角瓶内充分振荡混匀；

再用带有纱布的无菌漏斗过滤除去菌丝体，得分生孢子悬浮液；

（2）紫外线诱变处理：

取四份1╳10³cfu/mL的分生孢子悬浮液20 mL，置于四个带有转子的平皿中，再将平皿置于诱变箱中的磁力搅拌器上，打开皿盖，开启磁力搅拌器，转速为30 rpm，并将平皿置于紫外灯下方分别照射30 s、1 min、2 min、4 min、6 min后，关闭磁力搅拌器和紫外灯，盖上皿盖；

然后取紫外灯照射后的分生孢子悬浮液0.1 mL均匀涂布在平皿中的筛选培养基上，于30℃恒温箱中倒置培养96 h，观察平皿上是否出现蓝色透明水解圈以及水解圈的大小；

挑取平皿上产较大蓝色透明水解圈的菌落，进行摇瓶复筛，检测滤纸酶活，筛选出滤纸酶活最高的菌株作为亚硝基胍NTG诱变的出发菌株；

（3）亚硝基胍NTG诱变处理：

将步骤（2）筛选出的菌株按步骤（1）进行菌种活化处理，并制备成分生孢子悬浮液；

向1╳10³cfu/mL的分生孢子悬浮液中添加亚硝基胍溶液至亚硝基胍浓度为1 mg/mL（m/v），于30℃ 160 rpm下振荡培养30 min；