[发明专利]一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其涉及一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法。

背景技术

根据国际前列腺炎合作网1998年提出的前列腺炎分类方法，前列腺炎共分为四型。Ⅰ型：急性细菌性前列腺炎，指前列腺急性细菌感染；Ⅱ型：慢性细菌性前列腺炎，指前列腺慢性复发性细菌感染；Ⅲ型：慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合症(CP/CPPS)，其定义为病史在3个月以上，骨盆区疼痛或不适，不同程度的排尿或性交时不适，此型根据前列腺按摩液、精液中白细胞计数又分为炎症性和非炎症性两种亚型；Ⅳ型无临床炎症性前列腺炎，没有症状，只是在病理检查或检查其他症状时发现前列腺按摩液中存在白细胞才偶然被诊断。其中Ⅰ型、Ⅱ型患者数量少，Ⅳ型前列腺炎因无任何症状，勿须处理，亦无重要临床意义。只有Ⅲ型前列腺炎患者因常规检查及培养未能发现明确的病原体，病因不明，发病机制不清，不能进行针对性治疗，临床疗效差，而且患者数量占临床慢性前列腺炎患者的60％以上。

研究发现纳米细菌能分泌钙化脂多糖生物膜，具有较强的毒性。人体内感染的纳米细菌，主要经泌尿系统排出体外。排尿时尿道高压可引起尿液返流进入前列腺导管和腺胞内，在此过程中，尿液中的纳米细菌容易被伴随转移，进入到前列腺内，这可能在纳米细菌感染前列腺过程中发挥主要和积极的作用。此外，前列腺导管细长、弯曲、开口处口径小，与尿道成直角或斜行向上进入尿道，也有利于尿道病原体进入腺体，不利于腺体炎性渗出物排除和引流，病原体可长期寄生在其中。以上诸多因素为纳米细菌在前列腺内感染和致病提供了条件和可能。

关于纳米细菌与Ⅲ型前列腺炎和前列腺结石可能存在的病因学关系，目前国内外只有少数学者在临床方面进行了探索。Jones等最初研究结果显示，前列腺炎患者血清中纳米细菌抗原经过ELISA分析检出率显著高于正常男性及前列腺增生患者。Shoke等通过对顽固性Ⅲ型前列腺炎伴结石患者用四环素抗纳米细菌治疗后，发现患者临床症状显著改善，结石变小或消失；还有人分别从Ⅲ型前列腺炎患者的EPS及前列腺结石中分离、培养出纳米细菌细菌，并发现其中纳米细菌具有较高感染率，分别达62.5％、65％。在针对性治疗后，EPS中纳米细菌阳性率明显下降。因此推断纳米细菌与Ⅲ型前列腺炎和前列腺结石之间存在着较密切关系，考虑为其重要病因。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法，旨在为研究纳米细菌与Ⅲ型前列腺炎和前列腺结石之间可能存在的病因关系收集收集病原菌，更好地用于指导临床工作，减轻病患的身心痛苦和经济负担，节约更多的医疗资源。

本发明是这样实现的，一种纳米细菌的培养与形态学鉴定方法包括：

步骤一、EPS标本的采集：

消毒尿道外口，无菌操作取5ml初段尿记为VB1；排出约50～100ml尿液后再取5ml中段尿记为VB2；行经直肠前列腺按摩，无菌操作取1～2ml EPS，最后残留于尿道外口的1滴EPS涂于玻片上，行常规镜检；重新消毒尿道外口，取5ml按摩后初段尿记为VB3；

步骤二、EPS标本的处理：

分别取VB1、VB2、VB3、EPS1ml，用生理盐水稀释5倍，经0.45μm滤器过滤，4℃离心40min(20,000×g)，弃上清，留取管底1ml充分混匀，再用无菌生理盐水稀释5倍，经0.22μm滤器过滤，4℃离心40min(20，000×g)，弃上清，留取管底1ml充分混匀；

步骤三、结石标本的处理：

手术中无菌采取患者的结石标本，在1N HCl中浸泡30min，以去除矿物质，加入1M Tris进行中和，碾碎结石，用生理盐水配成5％浓度，用0.22μm滤膜过滤，4℃离心40min(20000×g)；

步骤四、标本的培养：

在步骤三所得述滤液中加入3～4ml含10％γ-FBS的RPMI1640培养基，在37℃、pH7.4、5％CO₂和95％空气条件下培养，每周观察并记录纳米细菌的生长情况；

步骤五、间接免疫荧光染色，荧光显微镜观察：

步骤三所得培养液4℃离心30min(20，000×g)，弃上清，留取底部0.5ml充分混匀，取1滴到玻片上，自然晾干，4％多聚甲醛固定15min，水洗后在70℃烤10min，滴加一抗，37℃孵育60min，PH7.4的PBS冲洗2min×3次，滴加二抗，37℃孵育40min，PH7.4的PBS冲洗2min×3次，80％甘油封片，置于荧光显微镜下观察，用PBS替代8D10抗体作为阴性对照；

步骤六、透射电镜扫描(负染法)：