[发明专利]大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法及其应用

权利要求书

1. 一种大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，包括酶联检测方法中涉及的抗大熊猫促黄体素抗体的制备方法，其特征在于，包括以下内容：

（1）特异多肽片段的设计与合成：分别设计并合成大熊猫LHβ亚基的两条特异多肽片段，记为LHβ-1和LHβ-2；所述LHβ-1的编码序列是序列表中的SEQ ID No.1，所述LHβ-2的编码序列是序列表中的SEQ ID No.2；将所述的LHβ-1和LHβ-2两条多肽片段分别与匙孔血蓝蛋白偶联，得到两种偶联免疫原，分别记为LHβ-KLH-1和LHβ-KLH-2；

（2）抗大熊猫促黄体素抗体的制备：将步骤（1）中所述的偶联免疫原LHβ-KLH-1免疫兔，对免疫后的兔进行心脏采血，并分离血得到血清，将得到的血清通过亲和层析，分步收集高浓度的纯化产物，然后通过超滤离心管进行浓缩，即得浓缩后第一种抗大熊猫促黄体素抗体；同时，将步骤（1）中所述的偶联免疫原LHβ-KLH-2免疫兔，并进行上述相同的操作后，得到浓缩后第二种抗大熊猫促黄体素抗体。

2. 根据权利要求1所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中将偶联免疫原免疫兔包括以下内容：首次免疫剂时，是将500ug偶联免疫原与等体积的弗氏完全佐剂混合均匀后，对兔进行注射免疫；两周后进行第一次加强免疫，将250ug偶联免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂混合均匀后，对兔进行注射免疫；一周后进行第二次加强免疫，免疫剂量和方法与第一次加强免疫相同；待兔耳缘静脉血清效价达1:10000倍后，进行第三次加强免疫，免疫剂量和方法与第一次加强免疫相同。

3. 根据权利要求1所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的心脏采血是在第三次加强免疫3天后进行。

4. 根据权利要求1所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，其特征在于，步骤（2）中所述的亲和层析的填料为蛋白G琼脂糖。

5. 一种大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，包括酶联检测方法中涉及的大熊猫促黄体素检测试剂盒，其特征在于，包括以下内容：权利要求1-4任一项所述的第一种抗大熊猫促黄体素抗体包被的96孔酶标板、生物素标记的权利要求1-4任一项所述的第二种抗大熊猫促黄体素抗体、抗生素蛋白链霉菌素-辣根过氧化物酶复合物、标准品、样品缓冲液、洗涤缓冲液、色原底物溶液和色原终止液；

所述的标准品为一条共计38个氨基酸的多肽片段，此多肽片段的编码序列为序列表中SEQ ID No.3。

6. 根据权利要求5所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，其特征在于，所述的色原底物溶液为TMB显色液；所述的色原终止液为浓度1M的硫酸溶液。

7. 一种权利要求1-6任一项所述的大熊猫尿液促黄体素的酶联检测方法，在大熊猫尿液促黄体素检测中的应用。