[发明专利]一种β‑葡萄糖苷酶及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物医药领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，尤其是酶法转化多组分人参皂苷Rb1和Rb2制备人参皂苷Rd的应用。

背景技术

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)是一种多年生五茄科人参属药用植物，是我国传统名贵中药材，其显著的抗肿瘤、抗炎、抗衰老活性一直以来都是研究的热点。随着现代分离和分析技术的进步，人参皂苷中的活性成分也得到了深入的解析，已分离鉴定的人参皂苷单体有50余种。

近年来，人参皂苷Rd因其独特的药理活性受到广泛的关注，其独特的肾脏保护功能和特异性阻断受体依赖性钙离子通道功能是其它单体所没有的，同时人参皂苷Rd还具有较强的促进神经干细胞分化和保护神经系统功能，除此之外，还具有治疗心血管疾病、炎症等功能。因此，开发一种高效专一、低成本且绿色的人参皂苷Rd生产工艺具有迫切的现实需要同时也具有重要的实际应用价值。

人参皂苷Rd相对于多组分人参皂苷(Rb1、Rb2、Rc、Re和Rg1)在人参中含量显著偏低，从人参中直接提取回收率低，无法应用于大规模生产；因其结构的复杂性，使得化学合成人参皂苷Rd更为困难，然而根据人参皂苷Rd在结构方面与多组分人参皂苷Rb1、Rb2的相比发现(图1)，它们都具有相同的达玛烷骨架，仅在碳20位相差一个糖基(吡喃葡萄糖基和阿拉伯吡喃糖基)。因此去除该20位的相应糖基即可得到所需产物人参皂苷Rd，而相比反应条件剧烈的物理及化学方法，生物酶法所适用的反应条件相对温和且高效专一，几乎不产生废弃物因此无污染，绿色环保。

针对目前已有的对转化人参皂苷Rd方面的研究及相关专利，发现其中存在的局限有：(1)大部分生物转化人参皂苷所用方式是微生物转化，但微生物转化所得产物品质难以控制，对产品的纯度及得率有较大影响，而酶处理专一性强，副产物少，因此发掘单一高效的糖苷水解酶能达到提高产物得率及纯度的目的；(2)在利用生物酶转化制备人参皂苷Rd研究中，可以通过β-葡萄糖苷酶催化人参皂苷Rb1来获得，但还没有通过微生物酶催化人参皂苷Rb2来获得，也没有发现能催化人参皂苷Rb2的β-葡萄糖苷酶。因此发掘高效转化人参皂苷Rb2的水解酶，特别是既能转化人参皂苷Rb1又能转化人参Rb2水解酶，对于制备人参皂苷Rd具有重大意义和应用前景。此外，提高制备Rd产量，对进一步转化Rd制备获得人参皂苷Rg3，Rh2和CK等更多活性物质也具有重要意义；(3)酶水解人参皂苷过程中的产物之一的葡萄糖对β-葡萄糖苷酶具有强烈的抑制作用，对酶活力有极大的影响，发掘耐糖能力优异的β-葡萄糖苷酶有利于提高酶催化的效率，该种性质对降低生产成本及能耗具有重要意义。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对上述局限性，本申请人提供一种具有较高阿拉伯吡喃糖苷酶活力的β-葡萄糖苷酶及其制备方法与应用，并通过基因工程技术获得催化效率高，热稳定性优异，能耐受高温的重组β-葡萄糖苷酶TPEBGL1，该重组酶TPEBGL1对人参皂苷Rb1和Rb2都具有较强的催化能力。同时，能耐受较高浓度的葡萄糖。因而可降低产物反馈抑制对酶活力的影响，此外，还创立了一种不需IPTG诱导即可高效表达该重组酶TPEBGL1的酶制备方法，因此通过TPEBGL1转化制备人参皂苷Rd的方法是一种高效、便捷的方法。

技术方案：一种β-葡萄糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述β-葡萄糖苷酶的制备方法，将SEQ ID NO.2所示的DNA片段插入表达载体获得重组质粒，将重组质粒转化宿主菌，以及其诱导表达条件和后续目的蛋白的纯化。

所述制备方法步骤如下：

1)、以提取的Thermotoga petrophila DSM 13995基因组DNA为模板，用具有SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列的下游引物扩增，PCR扩增得到SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2)、将得到的DNA分子和pET-20b分别用Nde I和Xho I进行双酶切，连接得到含有β-葡萄糖苷酶的核苷酸序列的重组质粒；

3)、将步骤2)得到的重组质粒转化表达宿主菌JM109(DE3)，不加IPTG于37℃下诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后经Ni²⁺亲和层析柱纯化即得。

包含所述β-葡萄糖苷酶的核苷酸片段的重组质粒。

所述β-葡萄糖苷酶在制备人参皂苷Rd中的应用。