[发明专利]一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29及其获得方法

权利要求书

1.一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29，其特征在于，所述抗菌肽CC29包括两对引物，其核苷酸序列为：

CCGTTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAGGCTGGTCAACACACTTTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCTAAGAAGACTCTAG

所述核苷酸序列前端引入三肽序列，所述核苷酸序列两端各加入了BamH I和Sal I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，所述抗菌肽CC29的分子量为3236.00；电荷数为+7.5；等电点为11.22；疏水力矩为0.35。

2.一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29的获得方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、根据Genbank中Chensirin序列以及实验室克隆得到的家蝇天蚕素抗菌肽序列，选取具有潜力的片段进行组合，应用生物信息学工具计算各组合的一级特征参数、预测二级和三级结构和抗菌活性，筛选出医疗潜力指数最大的组合CC29，在其两端加上Xho I和Xba I限制性内切酶位点和保护性碱基，末端加上终止密码子，合成两对引物F1、R1，F2、R2，应用重叠PCR技术合成CC29融合蛋白基因；

S2、构建CC29克隆载体、pGAPZαA/CC29并测序鉴定，构建表达载体pGAPZαA/CC29并测序鉴定，将重组的克隆pGAPZαA/CC29与表达载体pGAPZαA同时双酶切，获得的目的基因与同样酶切的表达载体连接构建重组表达载体pGAPZαA/CC29，将杂合抗菌肽CC29表达载体转化到宿主菌SMD1168中，获得杂合抗菌肽CC29的重组原核表达基因工程菌；

S3、使用IPTG对培养至对数期的杂合抗菌肽CC29大肠杆菌基因工程菌进行诱导，通过SDS-PAGE和western blot技术对CC29融合蛋白进行检测，以便确定其表达水平和表达方式；

S4、将杂合抗菌肽基因构建在毕赤酵母表达载体pGAPZαA上，电转化到宿主菌SMD1168后，使用YPD液体培养基培养3天，杂合抗菌肽表达出分泌蛋白；对表达载体表达出的蛋白进行层析纯化，纯化后的融合蛋白经甲酸切割后去除标签，然后进行定量，纯化样品保留；

S5、CC29的生物学活性鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种毕赤酵母菌基因工程杂合抗菌肽CC29的获得方法，其特征在于，所述步骤S5过程中包括：将杂合抗菌肽CC29经沸水浴2min、5min、10min、30min和60min的热稳定性检测；将杂合抗菌肽CC29在pH为1、2、5、7、10、12、14缓冲液中，以沙门氏菌为指示菌的杀菌活性检测；通过抑菌圈法和连续倍比稀释法测定杂合抗菌肽CC29对大肠杆菌、乳酸杆菌、鸡沙门氏菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌活性和最小抑菌浓度；采用红细胞血红素的释放测定杂合抗菌肽CC29的溶血活性。