[发明专利]基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物，和利用该引物构建鼠BCR轻链Lamda文库的方法。

背景技术

得益于下一代高通量测序技术的快速发展和广泛应用，DNA和RNA测序平台在基因组学的各个方面发挥着突出的推动作用。同时，这一新兴的技术领域已经被应用于T细胞和B细胞受体的免疫组库测序。在获得性免疫中，T细胞和B细胞通过表面的T细胞受体和B细胞受体特异性的识别抗原肽-主要组织相容性复合物(pMHC)进而启动免疫系统活化。通过测序淋巴细胞受体的CDR3免疫组库，确定T、B淋巴细胞中受体分子的组成，可以用以评价免疫组库的多样性等特征参数，并进一步研究获得性免疫系统的应答发生过程及其发生机制。

B细胞受体(BCR)由两条重链和两条轻链，共四条肽链组成，重链由IGH基因编码，轻链分别由IGL(Lamda链)和IGK(Kappa链)编码，同时由于轻链与重链相比具有相同的可变区长度，因而可以很好的反应。IGL基因的胚系基因由多个开放阅读框依次排列而成，可划分为IGLV，IGLJ，IGLC三组片段，在B淋巴细胞发育过程中通过体细胞重排实现不同片段间随机组合产生成熟的IGL分子，为BCR的多样性提供了分子遗传基础。在IGLV-IGLJ的连接处，由于非模版核苷酸的随机插入与缺失，大大增加了BCR分子的多样性程度。B细胞活化过程中，由于体细胞超突变(即亲和力成熟)及重组类型转换的作用，BCR的多样性进一步增加。而IGL基因的互补决定区3(CDR3)刚好覆盖IGLV-Junction-IGHJ区域，包括了IGL基因几乎全部的多样性信息，因此，对于B淋巴细胞IGL基因CDR3区域的序列组成进行测序可以很好的反映BCR免疫组库的组成及应答状况。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物；本发明的目的之二在于提供利用所述多重PCR引物构建鼠BCR轻链Lamda文库的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、基于高通量测序构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物，所述多重PCR引物如SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.13所示。

2、利用所述多重PCR引物构建鼠BCR轻链Lamda文库的方法，先提取鼠脾腺组织或外周血总RNA，然后以SEQ ID NO.1为反转录引物合成cDNA，以合成的cDNA为模板，SEQ ID NO.2～SEQ ID NO.13所示序列为引物进行多重PCR，回收PCR产物，将PCR产物进行微乳滴PCR，然后进行PGM测序，得鼠BCR轻链Lamda文库。

优选的，所述多重PCR的扩增条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，59℃退火90s，72℃延伸90s，循环35次；最后72℃后延伸10min。

本发明的有益效果在于：本发明公开了构建鼠BCR轻链Lamda文库的多重PCR引物，该引物能够扩增IGL基因CDR3区，能够构建鼠BCR轻链Lamda文库，本发明还公开了构建鼠IGL基因CDR3区测序文库的方法，实现了B细胞受体免疫组库的稳定检测，对进一步了解免疫组库变化规律、揭示疾病发病机制有重要意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为凝胶成像检测目的条带图(1：DL2000；2：鼠TCRB文库条带)。

图2为鼠TCRB文库统计结果。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、提取鼠组织中总RNA

鼠组织中总RNA的提取方法，包括如下步骤：

a.取鼠脾腺组织和外周血加入Trizol后吹打，室温静置5min，直接提取RNA或放入-80℃冰箱冻存；

b.按每微升Trizol加入200μl氯仿，颠倒混匀(30s)，室温放置3min，然后于4℃、12000g离心15min；

c.取水相，按每微升Trizol加入200μl氯仿颠倒混匀(30s)，室温放置3min，然后于4℃条件下12000g离心15min；